Diagnosis of Cat Scratch Disease with Detection of Bartonella henselae by PCR: a Study of Patients with Lymph node Enlargement

dyskusja

w tej pracy wykorzystaliśmy skuteczną i specyficzną metodę PCR do wykrywania genu htrA B. henselae w tkankach węzłów chłonnych. Zdecydowaliśmy się na badanie pacjentów wybranych na podstawie objawów klinicznych zgodnych z diagnozą CSD. Pozwoliło to określić wartość diagnostyczną testu PCR w różnych grupach pacjentów sklasyfikowanych według liczby kryteriów CSD, aby móc przewidzieć czułość metody PCR u pacjentów z większą lub mniejszą liczbą (czasami nie) kryteriów CSD. Takie podejście, jak wiemy, nigdy wcześniej nie było stosowane i jest bliskie temu, które stosuje lekarz, który musi postawić diagnozę pacjentowi z limfadenopatią bez wskazania etiologicznego. W porównaniu do klasycznych kryteriów diagnostycznych CSD, analiza PCR wykazała doskonałą swoistość, ponieważ w naszej grupie kontrolnej nie zaobserwowano wyników fałszywie dodatnich. Klasyczne kryteria pozostają jednak użyteczne, ponieważ wynik PCR może być czasami negatywny dla pacjentów z autentycznym CSD (7 z 29 pacjentów w określonej grupie CSD w naszym badaniu).

rozpoznanie tej choroby opiera się na kilku kryteriach podobnych do tych pierwotnie opisanych przez Debré i wsp. (8). Jednak śródskórny test skórny nie jest już dostępny w kilku krajach,a ponadto żadne z kryteriów początkowo stosowanych przez Debré et al. są markerami etiologicznymi choroby (8). Tak więc wśród klasycznych kryteriów nie wystarcza ani Historia kontaktu z kotami, ani samo badanie kliniczne lub histologiczne do rozpoznania CSD. Niewielka mniejszość pacjentów z zadrapaniami kotów rozwija CSD, a wiele przypadków możliwej adenopatii związanej z CSD można przypisać innym przyczynom. Podobnie obraz histologiczny zgodny z CSD można zobaczyć w innych stanach, takich jak tularemia, choroba Nicolasa Favre ’ a, a nawet mykobakterioza. Nowe kryteria, które obejmują serologię i diagnostykę PCR, powinny mieć wartość dla rozpoznania zakażenia wywołanego przez B. henselae.

badanie serologiczne na obecność przeciwciał B. henselae było pierwszym dostępnym badaniem mikrobiologicznym, ale obecnie ma zmienną dodatnią wartość prognostyczną. Jest to pośrednia metoda diagnostyczna, która może być ujemna we wczesnym stadium choroby. W niektórych badaniach (7, 11, 28) dodatnia wartość prognostyczna pośredniego testu immunofluorescencyjnego dla B. henselae była wysoka (≥91,4%). Odwrotnie, Bergmans et al. (6) oraz Dupon et al. (10) stwierdzono brak czułości testu serologicznego wśród pacjentów z CSD.

z drugiej strony, zarówno testy serologiczne CSD, jak i PCR specyficzne dla B. henselae były ujemne (1, 3, 4, 5, 6, 12, 19, 28) w przypadkach autentycznego CSD, a czułość wykrywania PCR jest często mniejsza niż 80%. Spośród badań, w których zbadano dobrze zdefiniowane przypadki CSD, żadne z nich nie wykazało, że jeden test PCR próbki węzłów chłonnych jest wystarczający do rozpoznania CSD. Avidor i in. (4) odnotowano Czułość 100%, stosując trzy różne testy PCR z trzema różnymi celami, ale nie jest to aktualna praktyka w rutynowej diagnostyce.

kilka grup już oceniło wartość diagnostyczną analizy PCR dla CSD (1, 3, 4, 5, 6, 12, 20, 27). Porównanie tych badań jest jednak trudne ze względu na różnice w celu PCR, rodzaju próby i kryteriach stosowanych do definiowania CDPW. W ten sposób kilka par starterów zostało użytych do wykrycia B. henselae przez amplifikację PCR(3, 4, 5, 6, 14). Cel 16S rRNA po raz pierwszy zastosowany przez Bergmans et al. (5) stwierdzono wrażliwość 96% u pacjentów z pozytywnym wynikiem testu skórnego na CSD i 60% u pacjentów z negatywnym wynikiem testu skórnego. W drugim badaniu ci sami autorzy (6) stwierdzili, że czułość wynosiła odpowiednio 86,4 i 100% u pacjentów z więcej niż dwoma lub więcej niż trzema kryteriami CSD. Gen htrA użyty w naszym badaniu był często wykorzystywany do testowania próbek klinicznych wśród pacjentów z podejrzeniem CSD. Anderson et al. (3) oraz Goldenberger et al. (12) uzyskano czułość odpowiednio 84 i 61%, tak że nasz wynik (czułość 76%) jest bliski najlepszemu dla tego celu (3, 4). Porównanie celów 16S rRNA i htrA wykazało lepszą czułość tych pierwszych (60 w porównaniu z 43%) (26). Avidor i in. (4) porównano Gen gltA (kodujący syntazę cytrynianową) z genami 16S rRNA i htrA i stwierdzono, że pierwsze dwa cele są bardziej czułe (odpowiednio 100 i 94%) niż Sekwencja htrA (69%). Inne cele PCR nie były testowane w naszej pracy. Jednak specyficzność wyników została zapewniona przez przetworzenie i amplifikację drugiej aliquot dla wszystkich próbek dodatnich.

wyniki fałszywie ujemne można wytłumaczyć brakiem czułości, co sugerują badania porównawcze Avidora i wsp. (4) i Sander et al. (25), lub przez obecność innych gatunków Bartonella w CSD (13, 16, 21). Słaba jakość próbek klinicznych bez tkanki węzłów chłonnych lub próbek pobranych po długim okresie antybiotykoterapii może również wyjaśniać niektóre z tych fałszywie ujemnych wyników. W większości badań próbki były świeżymi próbkami biopsji węzłów chłonnych lub ropą pobraną z węzłów chłonnych(3, 4, 5, 6). Dwie inne grupy stosowały stałe węzły chłonne osadzone w parafinie (26, 27) i uzyskały czułość od 40 do 70%, zgodnie z celem amplifikacji i kryteriami stosowanymi do określenia CSD.

rozpoznanie CSD musi opierać się na obecności kombinacji kryteriów epidemiologicznych, histologicznych i bakteriologicznych, ponieważ żadne pojedyncze kryterium nie może być uznane za złoty standard. Kryteria stosowane do zdefiniowania CSD mają zatem duże znaczenie dla oceny wrażliwości i specyficzności testów biologicznych stosowanych do jego diagnozy, na co zwróciło uwagę kilku autorów (6, 26, 27). Anderson et al. (3) oraz Avidor i wsp. (4) wybrani pacjenci z limfadenopatią, mający jedynie kontakt z kotami jako kryterium CSD. W naszym badaniu, te ostatnie kryteria błędnie zaklasyfikowały jednego z naszych pacjentów jako chorego na CSD, chociaż w rzeczywistości pacjent miał adenopatię ropogenną. Czułość testu PCR Sandera i Penno (26) wynosiła 65% przy zastosowaniu wyłącznie kryteriów histologicznych do definicji przypadku i wzrosła do 87%, gdy rozważano również wyniki serologiczne, co ilustruje niską swoistość kryteriów histologicznych. W badaniu Scott et al. (27) pacjenci zostali wybrani, ponieważ spełnili warunki histopatologiczne, a następnie poddani analizie według różnych kryteriów. Czułość testu PCR w tej pracy wynosiła 68% (27). W naszym badaniu dowody histologiczne były obecne u 84% pacjentów z klasycznymi kryteriami, ale tylko u 72% pacjentów, gdy zastosowano kryteria rozszerzone, w tym wyniki PCR. U trzech pacjentów, u których diagnoza ta ostatecznie nie została zachowana, wystąpiły objawy histologiczne zgodne z CSD. W naszych badaniach wykorzystaliśmy precyzyjnie zdefiniowane kryteria kliniczne, serologiczne, epidemiologiczne i histologiczne. Nasi pacjenci zostali wybrani nie tylko wśród osób z ustaloną wcześniej diagnozą CSD, ale także wśród wszystkich pacjentów z limfadenopatią i podzieleni na różne grupy, zgodnie z klasycznymi kryteriami diagnostycznymi. Pozwoliło nam to uzyskać dobrą ocenę czułości testu PCR.

Goldenberger i in. (12) sklasyfikowali swoich pacjentów na cztery kategorie (niektóre CDPW, możliwe CDPW, nieznana diagnoza i grupa kontrolna) i badali różne próbki, z których nie wszystkie pochodzą z przypadków limfadenopatii, i uzyskali czułość 61% i swoistość 100%. Aby oszacować wartość diagnostyczną naszego testu, szczególnie dla pacjentów z niepewnym CSD, wolelibyśmy ślepo skupić się na przypadkach limfadenopatii i zbierać dane prospektywnie, aby zdefiniować różne grupy przy użyciu zwykłych kryteriów CSD. W związku z tym określono wartość diagnostyczną htrA PCR wykrywania B. henselae jako dodatkowe kryterium dla CSD i rozszerzone kryteria, które obejmowały wynik PCR. Na podstawie naszych ustaleń jedynie pozytywny wynik testu PCR można uznać za wystarczająco specyficzny dla rozpoznania CSD, ponieważ żaden pacjent w grupie kontrolnej nie miał dodatniego wyniku testu PCR, w przeciwieństwie do wyników serologicznych (trzy wyniki fałszywie dodatnie) i histologicznych (dwa wyniki fałszywie dodatnie).

przyjmując podejście kliniczne, najpierw określiliśmy wartość diagnostyczną analizy PCR dla grupy pacjentów spełniających Klasyczne kryteria CSD. Dla takich pacjentów diagnoza jest na ogół łatwa do postawienia. Bardziej interesujący są pacjenci, którzy nie spełniają wszystkich kryteriów CSD, dla których diagnoza może być bardzo trudna, a test PCR B. henselae jest bardzo pomocny. Sytuacja ta jest częsta w praktyce klinicznej: brak lub niespecyficzna histolopatologia, negatywna serologia lub kontakt z kotami bez zadrapań, dając kilka kombinacji kryteriów. Jednak u naszych możliwych pacjentów z CSD, którzy przedstawili tylko jedno lub żadne z klasycznych kryteriów, ale dla których nie można było zachować żadnej innej diagnozy, test PCR B. henselae był pozytywny w trzech przypadkach. O ile ci trzej pacjenci zawsze wykazywali jedno z klasycznych kryteriów CSD, przetestowaliśmy wartość diagnostyczną kryteriów rozszerzonych (co najmniej dwa kryteria, w tym wynik PCR). Dzięki zastosowaniu tych nowych kryteriów ustalono rozpoznanie CSD dla dodatkowych 10% pacjentów. Tak więc, dzięki zastosowaniu testu PCR jako dodatkowego kryterium, czułość diagnozy CSD można poprawić bez zmniejszenia swoistości, zwłaszcza u pacjentów z niekompletnymi kryteriami diagnostycznymi. W naszym badaniu wykrywanie PCR B. henselae miało swoistość 100%. W związku z tym analiza PCR może być wystarczająca do rozpoznania CSD u pacjentów z limfadenopatią w obecności tylko jednego innego kryterium diagnostycznego. Co ciekawe, można było uniknąć biopsji węzłów chłonnych, ponieważ amplifikację PCR można wykonać z próbkami ropy pobranymi z węzłów chłonnych o dobrej czułości(cztery z pięciu próbek ropy z grupy z określonym testowanym CSD były dodatnie) i swoistości (próbki ropy uzyskano od trzech pacjentów z grupy kontrolnej, a wszyscy byli ujemni). Ze względu na małą liczbę pacjentów ten aspekt należy potwierdzić w dalszych badaniach.

inne bezpośrednie metody wykrywania zakażeń Bartonella, takie jak immunohistochemiczne barwienie lub hodowla, zostały zgłoszone do rozpoznania CSD. Metody te nie były stosowane w naszej pracy ze względu na ich brak wrażliwości i specyficzności. Hodowla na agarze czekoladowym wzbogaconym w IsoVitaleX została przeprowadzona w naszych badaniach i zawsze była negatywna.

aby ustalić diagnozę CSD u pacjentów z powierzchowną limfadenopatią w jednym izolowanym obszarze, proponujemy zastosowanie podejścia etiologicznego, które polega na szukaniu najpierw obecności DNA B. henselae poprzez analizę PCR. W przypadku pozytywnego wyniku PCR CDPW może zostać zatrzymany ze względu na doskonałą specyficzność. W przypadku ujemnego wyniku PCR rozpoznanie może opierać się na obecności co najmniej dwóch z następujących kryteriów: (i) dodatniej serologii, (ii) histologii zgodnej z CSD (ziarniniak pyogenny) lub (iii) kontaktu z kotami w dniach lub tygodniach poprzedzających powiększenie węzłów chłonnych, wraz z eliminacją jakiejkolwiek innej przyczyny powiększenia węzłów chłonnych (Fig. 1).