PMC

przerwy dwuniciowe w DNA mogą siać spustoszenie w komórkach, jeśli nie zostaną naprawione . Dlatego zaproponowano, że końce chromosomów mogą być wyspecjalizowanymi strukturami czapek, które nie są rozpoznawane jako przerwy dwuniciowe, zapobiegając w ten sposób zatrzymaniu cyklu komórkowego, degradacji i rekombinacji (Muller, 1938; McClintock, 1939). Teraz wiemy, że telomery zawierają końce chromosomów i są niezbędne dla stabilności genomu. Telomery składają się z tandemowych powtórzeń głowy do ogona o krótkiej sekwencji bogatej w G; na przykład telomery ludzkie to 2-20 kb powtórzeń (TTAGGG)N. Końce chromosomu nie są tępe, a koniec 3′ (nić bogata w G) zwisa w pojedynczą nić, która może zaatakować wnętrze telomeru, aby wyprzeć wewnętrzną sekwencję bogatą w G i utworzyć strukturę pętli t (Griffith et al., 1999; Cesare et al., 2003; Doksani et al., 2013), chroniąc w ten sposób końce chromosomu przed rozpoznaniem przez komórkę przerw dwuniciowych, oprócz ochrony przez białka wiążące telomerę.

chromosomy eukariotyczne są duplikowane przez replikację półkonserwatywną z wiodącym (ciągła Synteza dla wzrostu netto na 3′ końcu rodzącej się nici wiodącej) i opóźnionym (nieciągła synteza fragmentu Okazaki dla wzrostu netto na 5′ końcu rodzącej się nici opóźnionej) wydłużającym się pasmem, jak pokazano na Fig. 1. W chromosomalnej replikacji semikonserwatywnej krótki Starter 5 ’ RNA jest usuwany z rodzącej się nici, a luka jest wypełniana przez DNA, które jest ligowane do sąsiedniego rodzącego się DNA. Jednakże, na końcu chromosomu, Luka po usunięciu 5 ’ końcowego startera RNA na opóźnionej nici nie może być wypełniona, a chromosom może stać się krótszy z każdą następną rundą replikacji. Zostało to nazwane problemem końcowej replikacji (Watson, 1972; Olovnikov, 1973), a telomeraza pomaga rozwiązać ten problem (Greider and Blackburn, 1987; Soudet et al., 2014).

replikacja Półkonserwatywna występuje przed działaniem telomerazy. Wcześniej sądzono, że replikacja DNA rozpoczęła się na początku w chromosomalnym DNA przylegającym do powtórzeń telomerowych, z widełkami replikacyjnymi poruszającymi się dwukierunkowo od subtelomerycznego pochodzenia (Fig. 1 A), powielając w ten sposób telomere. Pozostaje jednak pytanie, czy replikacja DNA może rozpocząć się z pewną częstotliwością w samym telomerze (rys. 1 B). Na to pytanie Drosopoulos et al., who used single molecule analysis of replicated DNA (SMARD; Norio and Schildkraut, 2001). W tym podejściu replikujące komórki są kolejno znakowane przez dwa różne analogi nukleotydów, które są następnie identyfikowane przez immunofluorescencję. Na przykład w replikacji dwukierunkowej czerwone sygnały z pierwszego impulsu będą flankowane na każdym końcu zielonymi sygnałami z drugiego impulsu. Wcześniejsze doniesienia z wykorzystaniem SMARD doszły do wniosku, że większość replikacji inicjuje się w subtelomerycznych regionach w genomie myszy i człowieka, a rzadko w samych telomerach(Sfeir et al., 2009; Drosopoulos et al., 2012). W ostatnich badaniach przeprowadzonych przez Drosopoulos et al. (2015), fluorescencja hybrydyzacji in situ (FISH) przy użyciu sond z regionu telomeru umożliwiła analizę wzoru replikacji dla segmentu genomowego o rozmiarze 320 kb od końca ramienia chromosomu myszy 14q. ze względu na długi czas (4 h) dla pierwszego (czerwonego) impulsu, Zwykle obserwowano tylko czerwone Trakty sygnału w telomerze, ale ponieważ wiele takich cząsteczek nie miało czerwonego sygnału rozciągającego się do regionu subtelomerycznego, można wygodnie stwierdzić, że replikacja musiała zostać zainicjowana w telomerze (Fig. 1 B). Co więcej, niektóre cząsteczki miały czerwony sygnał w telomerze otoczonym zielonym sygnałem, potwierdzając ten wniosek. Chociaż w tych przypadkach nie było chromosom proksymalny sygnał zielony, chromosom dystalny sygnał zielony był rzadko spotykany. Tak więc, chociaż istnieją ograniczone dowody na dwukierunkową replikację pochodzącą z telomeru, jest bardzo jasne, że pochodzenie replikacji może istnieć w obrębie telomeru WŁAŚCIWEGO z widelcem replikacji, który rozciąga się w czasie do subtelomeru. Pozostaje zbadać, czy replikacja inicjuje się ze stosunkowo wysoką częstotliwością w telomerach chromosomów innych niż 14q.

te odkrycia podnoszą pytanie, czy pochodzenie replikacji DNA pokrywa się z prostym powtórzeniem sekwencji znalezionym w telomerach, czy zamiast tego, czy pokrywa się z inną sekwencją, która może być przeplatana w telomerze. Ten pierwszy jest sugerowany przez badanie z ekstraktami bez komórek Xenopus, które mogłyby zmontować kompleks przed replikacją i poddać się replikacji DNA na egzogennym DNA zawierającym wyłącznie powtórzenia telomeryczne (Kurth and Gautier, 2010). Podobne wnioski, które replikacja DNA może inicjować w prostych powtórzeniach DNA znalezionych w centromerach, w których obserwowano pęcherzyki replikacyjne w Drosophila virilis za pomocą mikroskopii elektronowej, zostały osiągnięte (Zakian, 1976), a ostatnie badania sugerują, że replikacja DNA inicjuje się w ludzkim Alfa-satelitarnym DNA (Erliandri et al., 2014).

widełki replikacyjne poruszają się powoli przez TELOMERYCZNE DNA (Ivessa et al., 2002; Makovets et al., 2004; Miller et al., 2006; Sfeir et al., 2009) ze względu na wysoką stabilność termiczną telomerycznego DNA bogatego w GC, a także jego skłonność do tworzenia stabilnych struktur wtórnych, takich jak G-quadruplex (g4) DNA, które mogą stwarzać problemy dla replikacji DNA (Lopes et al., 2011; Paeschke et al., 2011). Różne helikazy pomagają rozwiązać ten problem; na przykład helikaza Pif1 pomaga rozwinąć G4 (Paeschke et al., 2013). Bloom Syndrome helicase (BLM) i zespół Wernera helicase (WRN) były również zaangażowane w wspomaganie replikacji telomerów: BLM hamuje zależne od replikacji kruche telomery (Sfeir i wsp., 2009) i WRN tłumi defekty w syntezie nici opóźniających telomere (Crabbe et al., 2004). Drosopoulos et al. (2015) teraz raport, że wiodąca synteza nici, która inicjuje w telomerze, ma wolniejsze tempo progresji do subtelomeru w komórkach z niedoborem BLM, jak wizualizowano przez SMARD. Ponadto stwierdzono większą częstotliwość inicjacji replikacji w subtelomerze 14q komórek z niedoborem BLM, pochodzącym bliżej telomeru niż w komórkach z niedoborem BLM. Obserwacje te sugerują, że uśpione początki replikacji w subtelomerze 14q mogą być aktywowane, gdy progresja widelca jest utrudniona w komórkach z niedoborem BLM (Fig. 1 C). Drosopoulos et al. (2015) stwierdził również wzrost subtelomerycznej inicjacji replikacji, gdy progresja widelca replikacji z telomeru była utrudniona przez afidikolinę, jako alternatywny sposób aktywacji uśpionych początków przez stres replikacyjny. Gdy komórki leczono stabilizatorem g4 PhenDC3, wypalanie pochodzenia subtelomerycznego 14q zwiększyło się jeszcze bardziej w komórkach z niedoborem BLM. Łącznie dane sugerują spowolnienie postępu syntezy nici wiodącej z pochodzenia w telomerze 14q (z wykorzystaniem nici rodzicielskiej bogatej w G jako szablonu), gdy struktury G4 nie mogą być rozwiązane w komórkach z niedoborem BLM. Jako dalsze wsparcie dla roli helikazy BLM w usuwaniu struktur G4, stwierdzono zwiększone zabarwienie komórek z niedoborem BLM przez przeciwciało BG4 (Biffi i wsp ., 2013) przeciwko G4 w całym genomie, a zwłaszcza w telomerach.

HELICASE WRN może rozwinąć G4 in vitro (Fry and Loeb, 1999; Mohaghegh et al., 2001). Kiedy Drosopoulos et al. (2015) używane SMARD do analizy replikacji w komórkach podwójnie niedoborowych zarówno BLM, jak i WRN, odkryli wyraźny spadek sygnału replikacji Czerwonej w telomerach 14q, co sugeruje pewne funkcjonalne nakładanie się między BLM i WRN w odniesieniu do wiodącej syntezy nici poza nicią bogatą w G telomerów. Potwierdzając ten wniosek, było więcej barwienia G4 przez przeciwciało BG4 w komórkach z podwójnym niedoborem zarówno BLM jak i WRN niż w komórkach z niedoborem tylko BLM lub tylko WRN. Jest to pierwsza bezpośrednia demonstracja in vivo udziału helikazy BLM i WRN w rozdzielczości struktur G4, która jest szczególnie potrzebna do progresji syntezy nici wiodącej, która inicjuje się w telomerach i jest kopiowana z nici bogatej w G.