the Embryo Project Encyclopedia
w latach 1958-1961 Leonard Hayflick i Paul Moorhead w USA opracowali w laboratorium sposób na hodowlę szczepów ludzkich komórek z kompletnymi zestawami chromosomów. Wcześniej naukowcy nie mogli zrównoważyć kultur komórkowych komórkami, które miały dwa kompletne zestawy chromosomów, takich jak normalne komórki ludzkie (diploidalne). W rezultacie naukowcy podjęli próbę zbadania biologii komórek ludzkich, ponieważ nie było wiarygodnego źródła komórek, które reprezentowały diploidalne komórki ludzkie. W swoich badaniach Hayflick i Moorhead stworzyli trwałe szczepy komórek ludzkich, które zachowały oba kompletne zestawy chromosomów. Następnie zamrozili próbki z kultur, aby komórki pozostały żywotne dla przyszłych badań. Zauważyli również, że komórki mogą dzielić się tylko pewną liczbę razy, zanim zdegradują się i obumrą, zjawisko to zwało się później limitem Hayflicka. Eksperyment hayflicka i Moorheada umożliwiłbadanie na temat biologii rozwojowej i szczepionek, które opierały się na szczepach humancell.
Hayflick specjalizuje się w hodowli komórek w kontrolowanych środowiskach. W 1958 roku na zaproszenie nowego dyrektora Instytutu,Hilarykoprowskiego, wstąpił do Wistar Institute w Filadelfii w stanie Pensylwania, instytucji badawczej zajmującej się biologią komórek i wirusami. Koprowski zlecił Hayflickowi stworzenie kultur komórkowych na potrzeby eksperymentów innych badaczy w Instytucie. Hayflicklater przypomniał jednak, że swoje zadanie badawcze wykorzystał jako okazję do zbadania metod i ograniczeń kultur komórkowych. Aby pomóc w hodowli komórek, Hayflick zwerbował swojego kolegę z Wistar,Paula Moorheada, który badał strukturę i funkcję komórek ichromosomów.
brak długowieczności normalnych kultur komórek ludzkich w laboratorium ograniczone badania, które naukowcy mogą zrobić. Dzięki cellcultures naukowcy hodują populacje komórek w kontrolowanych warunkach szklanych do wykorzystania w badaniach. Badacze zazwyczaj hodują kultury komórek w naczyniach szklanych lub szalkach Petriego, które zawierają podłoże wzrostu, roztwór zawierający rozpuszczone sole, cukry i inne składniki odżywcze. W pierwszej połowie XX wieku naukowcy wysunęli hipotezę, że wszystkie normalne, zdrowe Kultury komórkowe miały nienaturalną zdolność do podziału w nieskończoność na podstawie wcześniejszych odkryćopublikowanych przez biologa Alexisa Carrela w 1912 roku w USA. W praktyce jednak naukowcy nie obserwowali niekończących się podziałów w normalnych komórkach.Zamiast tego komórki w hodowli ostatecznie zdegradowane i obumarły. Naukowcy stwierdzili, że komórki zdegradowane, ponieważ wyczerpały pożywkę wzrostu wszystkich składników odżywczych lub dlatego, że laboratoriom nie udało się utrzymać idealnych warunków środowiskowych dla wzrostu komórek. Jedynymi ludzkimi komórkami, które dzieliły się bezustannie inlaboratory settings, nazywanymi nieśmiertelnymi liniami komórkowymi, były komórki pochodzące z komórek nowotworowych. Te linie komórkowe reprezentowały tylko niektóre aspekty biologii komórek człowieka.
w połowie XX wieku badacze medyczni nie potrafili wyjaśnić, co spowodowało raka, a wielu naukowców,w tym Hayflick i Moorhead, wysunęło hipotezę, że pewne wirusy powodują narośla nowotworowe. Chociaż wielu mikrobiologów używało komórek pochodzących z linii komórkowych nowotworowych w badaniach medycznych, komórki na ogół nie były używane w opracowywaniu szczepionek, ponieważ naukowcy obawiali się, że szczepionki będą zanieczyszczone wirusami powodującymi raka, prawdopodobnie zawartymi w samych komórkach. Ponadto komórki z linii nowotworowych, ze względu na ich stały podział, były heteroploidalne, co oznacza, że miały większą lub mniejszą liczbę chromosomów niż normalne komórki ludzkie, które mają dwa kompletne zestawy chromosomów. Komórki heteroploidowe często wynikają z ciągłego podziału komórek przez wiele pokoleń komórek.
Hayflick i Moorehead wytworzyli ludzkie komórki, które mogły być aktywowane przez wiele pokoleń, jak komórki z linii nowotworowych, ale także zachowali diploidalną liczbę chromosomów komórek i zmniejszyli ryzyko ze strony teoretycznych wirusów powodujących raka. Opisali swój eksperyment w „The seryjny uprawa ludzki DiploidCell szczepy”, opublikowany w 1961.
Hayflick i Moorhead poszukiwali szczepów ludzkich komórek, które mogłyby być hodowane przez długie okresy czasu w laboratorium, ale nadal zachowały swoją diploidalną liczbę chromosomów. Postawiono hipotezę, że gdyby zostały one wszczepione małe próbki diploidalnych ludzkich komórek z już rosnących kultur do nowego środowiska wzrostu, znacznie zwiększyłyby liczbę diploidalnych komórek w kulturze. Hayflick i Moorhead zaproponowali, że zamrażanie małych ilości diploidalnych komórek zatrzyma wzrost i podział komórek bez zabijania komórek. Zamrożone komórki mogły być następnie przechowywane, dopóki naukowcy ich nie zażądali, w którym to momencie mogli zatrzymać zamrożone komórki, przywracając je do normalnej aktywności komórkowej.Hayflick i Moorhead przewidywali, że po rozmrożeniu te kultywowane komórki nie staną się heteroploidalne jak komórki z innych linii i zachowają swój diploidalny zestaw chromosomów. badania Hayflicka i Moorheada miały na celu zarówno stworzenie metody hodowli ludzkich komórek diploidalnych w laboratorium do długotrwałego użytku badawczego, jak i określenie, czy szczepy te przyczyniły się do wzrostu nowotworowego.Hayflick i Moorhead po raz pierwszy wyhodowali komórki ludzkie w kulturach laboratoryjnych, przeszczepili małe próbki komórek do nowych pojemników, aby uruchomić dodatkowe Kultury komórkowe i zamrozili próbki komórek z tych kultur, aby zachować komórki do późniejszych badań. Następnie, aby sprawdzić, czy zamrożone komórki były nadal opłacalne do badań, Hayflick i Moorhead zbadali zamrożone komórki i podjęli próbę wyhodowania z nich kultur komórkowych.Na koniec wszczepiono próbki tych ludzkich szczepów komórek diploidalnych w tkankach, aby sprawdzić, czy nie doprowadziły do wzrostu nowotworowego.
aby rozwinąć szczepy komórek ludzkich, Hayflick i Moorhead zaczęli hodować komórki z 25 różnych tkanek pobranych z poronionych płodów. Komórki te stały się 25 różnymi szczepami komórek ludzkich, nazwanymi numerycznie WI-1 przez WI-25. WI oznaczało Instytut Wistar, w którym rozwijano komórki. Hayflick i Moorhead używali tkanek płodu, ponieważ bardziej niż dorosłe komórki, komórki płodu łatwiej rozwijają się w komórkach fibroblastów, które są wyspecjalizowanymi komórkami, które zapewniają strukturalne wsparcie dla większości tkanek ciała. Komórki fibroblastów były przystosowane do laboratoryjnej hodowli komórek, ponieważ rosły szybko i stale w hodowlach komórkowych, zapewniając obfitość komórek do badań. Hayflick i Moorhead przecięli każdą z próbek tkanek w małe, cienkie plastry, a następnie wszczepili je na wewnętrzną ścianę szklanych butelek wypełnionych pożywką bogatą w składniki odżywcze. Hayflick i Moorhead umieścili pokryte tkankami butelki każdego szczepu komórkowego w ciepłym środowisku przez trzy dni, regularnie zastępując pożywkę wzrostową świeżą dostawą, aby rozpocząć hodowlę komórkową.
Hayflick i Moorhead pozwalają kulturom rosnąć, dopóki komórki nie pokryją całej szklanej butelki. Każda próbka komórek płodowych została następnie podzielona przez proceszazwany subcultivation. Podczas subkultury Hayflick i Moorheadrem przenieśli niewielką próbkę komórek i wszczepili je na ścianę nowej szklanej butelki wypełnionej pożywką wzrostu, tworząc nową kulturę komórek tego samego szczepu komórek. Każda nowa hodowla komórkowaodstawia nową generację komórek, które mogą być dalej kultywowane tą samą metodą, umożliwiając wykładniczy wzrost całkowitej liczby komórek. Hayflick i Moorhead podzielili próbki pozostałych komórek na małe porcje i zamrozili je, aby zatrzymać wzrost komórek i powstrzymać dalszy podział komórek.
Hayflick i Moorheadkontynuowali subkultywację komórek dwa razy w tygodniu przez około dziesięć miesięcy, w którym to momencie Kultury komórkowe przestały rosnąć i zaczęły się degradować.Hayflick i Moorhead wysunęli hipotezę, że komórki przestały się dzielić z powodu nagromadzenia toksycznych produktów wzrostu komórkowego w pożywce wzrostu. Hayflick i Moorhead próbowali wprowadzić świeży wzrost, który był wolny od wszelkich możliwych toksyn, ale hodowle komórkowe ulegały degradacji i umierały w ciągu następnych kilku miesięcy. Jednak inne kultury komórkowe umieszczone w tym samym podłożu wzrostu nie ulegały degradacji i nie umierały. Naukowcy doszli do wniosku, że coś w komórkach, a nie ich środowisku, spowodowało ich pogorszenie.
hayflick i Moorhead następnie próbowali ustalić, czy komórki, które zamarzły, mogą być nadal używane do uprawy większej liczby kultur komórkowych. Po rozmrożeniu małych próbek komórek, Hayflick i Moorhead umieścili komórki na ścianach szklanych butelek. Ponownie aktywowali je w mediach wzrostu i odkryli, że nawet po zamarznięciu komórki nadal rosły w nowych kulturach, które mogłyby być subkulturowe. Niezależnie od wcześniejszych zamrożeń lub subkultur,naukowcy mogli wykorzystać próbki z diploidalnych kultur ludzkich komórek do wzrostu więcej diploidalnych kultur ludzkich komórek. Hayflick i Moorhead stworzyli szczep ludzkich komórek adiploidalnych, który mógł być uprawiany w kulturach laboratoryjnych w nieskończoność.
Hayflick i Moorhead następnie zbadali, czy komórki wyhodowane w nowych kulturach nie są diploidalne. Pisząc o eksperymencie, powiedzieli, że obawiają się, że komórki mogą nie pozostać diploidalne, ponieważ wyhodowały je przez wiele pokoleń, co może prowadzić do heteroploidalności. Za pomocą mikroskopów świetlnych Hayflick i Moorhead przyglądali się próbkom komórek podczas metafazy podziału komórek, gdy chromosomy są wyraźne i łatwo oglądane. Policzyli liczbę chromosomów w 250indywidualnych komórek, aby uzyskać oszacowanie, ile komórek nadal miało adiploidalną liczbę chromosomów. Hayflick i Moorhead stwierdzili, że ponad 97% komórek było diploidalnych nawet po ponad 20generacjach subkultury. Hayflick i Moorhead doszli do wniosku, że ich proces seryjnej uprawy i zamrażania komórek płodowych był skuteczną metodą zachowania diploidalnego szczepu komórek ludzkich.
wreszcie Hayflick i Moorhead musieli pokazać,że ich szczepy komórkowe nie powodują raka. Problem z nieśmiertelnymi liniami komórkowymi utworzonymi z komórek nowotworowych polegał na tym, że naukowcy wysunęli hipotezę, że komórki mogą zawierać wirusy powodujące raka. Aby upewnić się, że ich szczepy newcell nie powodują raka, Hayflick i Moorhead przetestowali szczep komórkowy Wi-25 w żywej tkance. Wybrali sitko WI-25, ponieważ przeszło najwięcej podziałów i było najbardziej prawdopodobnym szczepem powodującym raka. W związku z tym, gdyby tak nie było, byłoby prawdopodobne, że żaden z pozostałych szczepów też by tego nie zrobił.
badacze wszczepili komórki szczepu WI-25 do torebek policzkowych pięciu żywych. Jako eksperymentalna grupa kontrolna wszczepili również pięć innych torebek policzkowych chomików komórkami pochodzącymi z linii nowotworowych. Początkowo pojawiły się guzki, wczesne oznaki rozwoju raka, w torebkach kontrolnych obu zestawów chomików. Jednak po trzech tygodniach prawie wszystkie guzki w chomikach wszczepionych komórkami WI-25 zniknęły, podczas gdy guzki w chomikach wszczepionych komórkami z linii komórek nowotworowych wzrosły. Hayflick i Moorhead przeprowadzili biopsje pozostałych guzków, aby potwierdzić ich przewidywania, że ich subkultywowane komórki nie powodowały raka.Biopsje wykazały, że guzki w chomikach wszczepione komórkami z linii nowotworowych rzeczywiście były nowotworowe, podczas gdy komórki WI-25 były spowodowane zapaleniem i krwawieniem w miejscu implantacji.
Hayflick i Moorhead również wszczepili podobny ludzki mózg komórkowy, WI-1, w tkanki mięśniowe pięciu umierających pacjentów z rakiem.Wszczepił również komórki z linii nowotworowych pięciu innym pacjentom z rakiem kończyn. Podobnie jak u chomików, początkowo guzki pokrywały miejsca implantacji obu grup. Po kilku dniach guzki wi-1 zaczęły się cofać, a guzki namnażały się wszczepiając komórki z linii nowotworowych. Pod koniec tygodnia prawie wszystkie guzki WI-1 zniknęły, a Hayflick i Moorhead przeprowadzili biopsję pozostałych guzków w obu grupach. Wyniki biopsji wykazały, że guzki komórek nowotworowych były heteroploidami, podczas gdy guzki WI-1 były diploidalne i nienowotworowe. Wyniki badań hayflicka i Moorheada, które opublikowali w 1961 roku,pokazały, że ludzkie diploidalne komórki mogą być rozmnażane przez wiele pokoleń, jak linie komórkowe nowotworowe, bez stania się heteroploidalnymi lub rakowymi.
wyniki miały natychmiastowy i trwały wpływ na zrozumienie biologii rozwoju i badań naukowych. Wyniki ich eksperymentu potwierdziły hipotezę Carrela z 1912 r., że normalne komórki rosły w nieskończoność w kulturze, pomimo obserwacji degradujących się kultur komórkowych z czasem. Carrel zasugerował, że w praktyce wydaje się, że komórki ulegają pogorszeniu, a wiek jest spowodowany niedoskonałymi laboratoryjnymi warunkami wzrostu komórek.Carrel twierdził, że w idealnych warunkach komórki w kulturach mogą się dzielić w nieskończoność, skutecznie działając jako nieśmiertelna linia komórkowa.Odkrycia hayflicka i Moorheada wskazywały jednak, że starzenie się organizmów zachodzi na poziomie komórkowym, proces zwany starzeniem się, a komórki mogą przejść tylko ograniczoną liczbę podziałów, zanim ulegną degradacji i obumarciu. Podczas eksperymentu Hayflick i Moorhead zajmowali się ciągłą hodowlą komórek płodowych, zastępując stare pożywki świeżym, bogatym w składniki odżywcze pożywką. Okazało się jednak, że po około czterdziestu lub sześćdziesięciu pokoleniach komórki zaczęły umierać szybciej niż rozmnażać się, co później nazwano limitem Hayflicka. Wynik ten wykazał, że komórki nie mogą rosnąć w nieskończoność, nawet w idealnych warunkach.
metoda hayflicka i Moorheada seryjnej hodowli ludzkich komórek diploidalnych pomogła naukowcom w utrzymaniu obfitego zaopatrzenia w diploidalne komórki ludzkie do badań. Według obliczeń hayflicka i Moorheada, pojedynczy szczep komórek ludzkich mógł być subkultywowany wystarczająco razy, aby wyprodukować prawie 20 ton żywych komórek. Chociaż nie jest technicznie nieśmiertelny, zapas ten stałby się niewyczerpalny dla praktycznych celów badawczych.
ponadto wytworzenie żywych diploidalnych komórek ludzkich umożliwiło badania nad szczepionką.Ponieważ Hayflick i Moorhead wykazali, że ich szczepy komórek ludzkich nie powodowały raka u chomików ani u ludzi, szczepy te można było stosować bez ryzyka skażenia szczepionki jakimś środkiem powodującym raka. Kolejne podobnie pochodzące szczepy komórek ludzkich, takie jak WI-38, stały się podstawą szczepionek na choroby dziecięce, takie jak różyczka i ospa wietrzna.
podczas gdy wielu badaczy z zadowoleniem przyjęło rozwój szczepów ludzkich komórek przez Hayflicka i Moorheada, niektórzy,w tym Kościół katolicki, nie pochwalali stosowania przerwanego materiału fetalmaterial w rozwoju szczepionek ze względów religijnych. Vatican stwierdził później, że sprzeciwiał się metodzie opracowywania szczepionek pochodzących z tkanek płodu, a nie indywidualnemu stosowaniu tych szczepionek w celu zapobiegania chorobom.
Hayflick i Moorhead wykazali,że nie tylko komórki ludzkie mogą być skutecznie hodowane w laboratorium, zachowując jednocześnie diploidalną liczbę chromosomów, ale także, że mogą one utrzymywać komórki prawie w nieskończoność poprzez subkulturę seryjną. Ponadto, ich eksperyment położył fundament dla Hayflicka do dalszych badań granicy podziału komórek w kulturze, zwanej później limitem Hayflicka. Odkrycia hayflicka i Moorheada pozwoliły na dalsze eksperymenty w zakresie biologii rozwojowej i rozwoju szczepionek, dostarczając obfite komórki ludzkie do badań.