Wczesne monitorowanie leczenia gruźlicy za pomocą Xpert® MTB/RIF

do Redakcji:

postępy w poprawie zdolności laboratoryjnych w zakresie diagnostyki gruźlicy doprowadziły do opracowania testów molekularnych, które obecnie zastępują konwencjonalne metody mikroskopowe i oparte na hodowli na dużą skalę . Niestety, obecne techniki molekularne wykrywają zarówno żywe, jak i martwe bakterie, a pozytywny wynik nie implikuje żywotności patogenu. Rzeczywiście, DNA może utrzymywać się przez długi okres po śmierci bakterii i kwasu nukleinowego z martwych bakterii jest równie amplifiable. Z tego względu testy molekularne nie nadają się do monitorowania leczenia i/lub kontroli zakażeń.

zgłaszamy innowacyjne podejście do selektywnego wzmacniania DNA pochodzącego z żywych Mycobacterium tuberculosis w próbkach klinicznych, co jest przydatne do monitorowania obciążenia prątkami u pacjentów z gruźlicą płuc podczas leczenia przeciwtb.

protokół opiera się na wstępnej obróbce próbek monoazydem propidium (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, USA)-związek chemiczny, który może interkalować DNA organizmów nieżywotnych (lub uszkodzonych błoną), ale jest wykluczony z żywych bakterii. Po aktywacji światła PMA wiąże się kowalencyjnie z DNA, zapobiegając jego amplifikacji przez PCR . Po ekspozycji na światło niezwiązany PMA nie jest w stanie dalej oddziaływać z cząsteczkami DNA.

test został najpierw zoptymalizowany przy użyciu prątków plwociny prątków kwasoodpornych (AFB) ujemnych z dodatkiem martwych lub żywych prątków w różnych stężeniach. W skrócie, żywe komórki Mycobacterium fortuitum dodano do odkażonych N-acetylo-cysteiny próbek plwociny ujemnych dla AFB przez rozmaz mikroskopii w końcowym stężeniu 106 bakterii * mL−1· Część tej laboratoryjnej próbki poddano obróbce cieplnej w celu zabicia komórek M. fortuitum. Roztwór podstawowy PMA został przygotowany i przechowywany w temperaturze -20°C i chroniony przed światłem, aż do użycia, zgodnie z zaleceniami producentów. PMA dodano jako obróbkę wstępną w końcowym stężeniu 500 µM i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 4°C w ciemności, a następnie poddano działaniu światła diody elektroluminescencyjnej (LED)-aktywnego światła (GenIUL, Terrassa, Hiszpania) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie DNA ekstrahowano za pomocą standardowej procedury chloroformu fenolowego. W celu oceny skuteczności etapu ekspozycji na światło, porcję nagiego DNA wyekstrahowanego z kultury M. fortuitum potraktowano 500 µM PMA wcześniej wystawioną na działanie światła LED przez 15 minut. Następnie przeprowadzono test próbny (genotyp® Mycobacterium CM; Hain Lifescience, Nehren, Niemcy )w celu identyfikacji klinicznie istotnych gatunków prątków. Próbki zawierające żywe M. preparat fortuitum wykazywał normalny profil hybrydyzacji na pasku nitrocelulozowym, podczas gdy próbki poddane obróbce w celu zabicia bakterii nie wykazywały żadnej amplifikacji, z wyjątkiem kontroli wewnętrznej (dane nie zostały przedstawione). Ponieważ nagie DNA poddane działaniu inaktywowanego światłem PMA wykazywało prawidłowy profil hybrydyzacji, etap ekspozycji na światło był skuteczny i PCR nie był dalej hamowany przez resztkowy PMA.

po zoptymalizowaniu protokołu inaktywacji DNA pochodzącego od martwych bakterii, dostosowaliśmy go do zautomatyzowanego testu Xpert® MTB/RIF (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA). PCR w czasie rzeczywistym wykonywane przez Xpert ® MTB / RIF zapewnia cykle progowe (ct), które można wykorzystać do obliczenia różnicy wydajności amplifikacji między próbkami z wstępną obróbką PMA i bez niej (ΔCt): niski ΔCt oznacza obecność amplifikowanego DNA z żywych bakterii, natomiast wysoki ΔCt oznacza, że docelowy DNA w próbce pochodzi od martwych lub uszkodzonych bakterii, a zatem wstępna obróbka PMA znacząco wpływa na jej amplifikację. Aby obliczyć wartość ΔCt, wzięliśmy pod uwagę średnią wartości Ct dla każdej sondy objętej testem Xpert® MTB/RIF (od A do E) .

przetestowaliśmy protokół PMA przy użyciu testu Xpert® MTB/RIF na krzywej kalibracji Ct próbek klinicznych z ujemnym wynikiem AFB z zabitymi/żywymi prątkami dodawanymi w różnych proporcjach. Wysokie współczynniki martwe-żywe powodowały maksymalną różnicę w wartościach ΔCt między poddanymi obróbce cieplnej i żywymi częściami z PMA, podczas gdy próbki zawierające podobny odsetek zabitych i żywych bakterii nie mogły być odróżnione od siebie poprzez zastosowanie wstępnej obróbki PMA (dane nie zostały przedstawione). Podobne dane zostały zgłoszone przez Kralik et al. .

wreszcie przetestowaliśmy podejście na próbkach klinicznych. Do pierwszego badania walidacyjnego włączono 10 pacjentów, u których zdiagnozowano czynną gruźlicę płuc (plwociny z plwociną dodatnią i posiew dodatni). Próbki pobrano w momencie rozpoznania (T0) i po 10-20 dniach terapii (t1), odkażono N-acetylo-cysteinę i poddano obróbce do hodowli ciekłej MGIT-960 (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi . Wszyscy pacjenci byli nadal AFB-dodatni przez rozmaz plwociny w mikroskopie t1. Równolegle 250 µL odkażonych próbek poddano analizie molekularnej metodą Xpert ® MTB/RIF z wstępną obróbką PMA lub bez niej. Próbki były następnie przetwarzane zgodnie z zaleceniami producenta dla testu Xpert ® MTB/RIF.

jak pokazano na fig. 1, PMA nie wpływa znacząco na wydajność PCR próbek pobranych w T0(średnia ± sem ΔCt 2,3 ± 0,5), podczas gdy próbki pobrane podczas leczenia W T1 wykazały ΔCt 10,5±0,9 po leczeniu PMA (p=0,0003) potwierdzając, że pozytywność rozmazu plwociny tych próbek była głównie spowodowana wysoce uszkodzonymi bakteriami. Ponadto, ΔCt obliczone między t0 i t1 w próbkach nieleczonych PMA okazało się zbyt niskie (ΔCt 2,9±0,9), aby ocenić rzeczywisty spadek obciążenia bakteryjnego spowodowany terapią.

dwóch pacjentów ocenionych jako „niski” na t0 przez Xpert® wykazało ujemną hodowlę na t1, podczas gdy wszyscy inni pacjenci oceniani jako „średni” lub „wysoki” pozostali dodatni w hodowli przez MGIT. Chociaż nie można ocenić dokładnego czasu do uzyskania pozytywnego wyniku, zaobserwowaliśmy, że kultury z próbek pobranych w T1 stały się dodatnie około 7-10 dni później w porównaniu z kulturami z próbek pobranych w t0, co sugeruje znaczne zmniejszenie żywego ładunku bakterii.

wszyscy pacjenci zostali skutecznie leczeni i wyleczeni pod koniec leczenia, co było zgodne z redukcją żywych bakterii wykrytą w teście PMA.

jako kontrolę negatywną, retrospektywnie uwzględniliśmy również przypadek niepowodzenia leczenia (dodatni wynik AFB i dodatni wynik hodowli po 5 miesiącach standardowego leczenia). W tym przypadku wstępne leczenie PMA zarówno w przypadku odkażonych próbek plwociny pobranych po 1 miesiącu, jak i po dwóch w trakcie leczenia nie miało istotnego wpływu na wydajność PCR (ΔCt ∼2), wspierając tym samym nieskuteczność leczenia przeciw gruźlicy.

ten sam protokół powinien być w zasadzie zgodny z innymi zatwierdzonymi przez CE badaniami molekularnymi i testami sond liniowych zatwierdzonymi przez Światową Organizację Zdrowia w zakresie diagnostyki gruźlicy; konieczne są dalsze badania, aby wykluczyć tę możliwość.

poprzednie badania wykazały możliwość stosowania PMA do rozróżniania żywych i martwych prątków przy stężeniu 25-50 µM. Podczas tworzenia protokołu, końcowe stężenie 100 µM całkowicie uniknęło amplifikacji DNA pochodzącego z zabitego przez ciepło M. fortuitum; zaobserwowano słabe tło z powodu amplifikacji DNA z zabitego przez ciepło M. tuberculosis (dane nie pokazano). Możemy spekulować, że inny skład ściany komórkowej w jakiś sposób wpływa na zdolność PMA do penetracji uszkodzonych prątków. Rzeczywiście, Kralik et al. zaobserwowano, że wywołana PMA redukcja sygnału pomiędzy żywymi i martwymi Mycobacterium avium subsp. paratuberkuloza była mniejsza w porównaniu z innymi gatunkami bakterii. Ponadto, biorąc pod uwagę ilość zanieczyszczeń, które mogłyby potencjalnie sekwestrować cząsteczki PMA w odkażonej spucie, zwiększyliśmy końcowe stężenie do 500 µM. Dalsze badania oceniające różnice wpływu leczenia PMA na szczepy wykazujące różny skład ściany komórkowej (np. szczepy Pekińskie) i / lub w spucie o różnych właściwościach (np. plwocina zawierająca krew) może lepiej wyjaśnić przydatność tego testu w różnych warunkach klinicznych.

według LØvdal et al. , niewielka część komórek, co do których przypuszcza się, że są martwe lub ciężko ranne, nie jest w stanie rosnąć. Obecność niewielkiej liczby komórek, które są ciężko ranne, ale nie nadają się do hodowli, może wyjaśnić, dlaczego nadal mamy pozytywny sygnał w próbkach pobranych w T1 pomimo wstępnego leczenia PMA. Wstępne leczenie PMA nie pozwala uniknąć wykrycia niewielkiego odsetka martwych komórek (fałszywie dodatni wynik testu żywotności): test może zatem przecenić żywotne prątki. Jednak z klinicznego punktu widzenia stanowiłoby to niewielki błąd w porównaniu z ryzykiem (bardzo małym dla tego testu) niedoszacowania żywych prątków.

nasze dane wskazują po raz pierwszy, że ilościowe techniki molekularne w połączeniu z metodą PMA mogą być alternatywą dla bezpośredniej mikroskopii i hodowli w celu monitorowania wczesnej odpowiedzi na leczenie i wstępnej oceny spersonalizowanych schematów leczenia. Zastosowanie tego testu może umożliwić wcześniejszą ocenę skuteczności leczenia, wykazując wyraźne zmniejszenie istotnego obciążenia prątkami. Jednakże, brak odpowiedzi na leczenie może być również szybko zidentyfikowany za pomocą testu umożliwiającego zmianę schematu leczenia i ograniczającego rozprzestrzenianie się infekcji i dalszy rozwój oporności .

• ©ERS 2012