Wykrywanie MRSA
metody wykrywania i identyfikacji gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA)
kluczowe punkty
- Gram +ve coccus
- klastry komórek przypominające Winogrona
- oporny na metycylinę i inne penicyliny
- może być również określany jako ORSA
gronkowiec złocisty oporny na metycylinę (MRSA) został po raz pierwszy zgłoszony na początku lat 60-tych i jest obecnie uważany za główny patogen nabyty w szpitalu na całym świecie. Termin oporność na metycylinę jest historycznie używany do opisania oporności na którykolwiek z tej klasy środków przeciwdrobnoustrojowych. Obecnie w USA OK. 35% szpitalnych szczepów S. aureus jest opornych na metycylinę (lub inne antybiotyki penicylinowe), a w ostatnich latach pojawienie się opornego na wankomycynę S. aureus (VRSA) spowodowało dodatkowy niepokój.
oporność występuje, gdy organizm posiada gen mecA wytwarzający zmienione białko wiążące penicylinę, PBP2a (znany również jako PBP2′) i MIC oksacyliny 2 mg/l lub MIC metycyliny 4 mg/l.
zakażeni i skolonizowani pacjenci są rezerwuarem MRSA zarówno w szpitalach, jak i w społeczności, a transmisja odbywa się zazwyczaj poprzez kontakt z pracownikami służby zdrowia.
skuteczna, szybka diagnostyka laboratoryjna i testy wrażliwości mają kluczowe znaczenie w leczeniu, leczeniu i zapobieganiu zakażeniom MRSA.
techniki wykrywania
laboratoryjne badania przesiewowe w kierunku MRSA to złożona równowaga między szybkością wyniku, czułością, swoistością i kosztami.
obecnie większość badań przesiewowych odbywa się metodami płytkowymi. Badania sugerują, że ta grupa metodologii odpowiada za >90% przeprowadzonych badań przesiewowych.
jednak coraz częściej stosuje się szereg metod alternatywnych, w tym metody oparte na bulionie, nośniki chromogenne, zestawy do szybkiego przesiewania, testy molekularne i zautomatyzowane systemy. Izolacja z wymazów przesiewowych może być długotrwała ze względu na liczbę „zanieczyszczających” organizmów obecnych w wymazach z miejsc niesterylnych.
pożywki wzbogacające oparte na bulionie są powszechnie stosowane w celu zwiększenia czułości. Jednak jest to kosztem szybkości wyniku. NaCl jest zwykle dodawany do bulionu zasadowego wraz z metycyliną, oksacyliną, cefoksytyną. Związki wskaźnikowe można również wykorzystać do wczesnego wskazania obecności MRSA.
stałe Media agarowe: nie istnieją uniwersalne znormalizowane metody przesiewania i izolacji MRSA przy użyciu stałych mediów agarowych. Dostępnych jest wiele mediów selektywnych, które polegają na inhibitorach, takich jak NaCl i/lub antybiotykach, aby wspomóc selekcję, wraz ze wskaźnikiem pH, aby podkreślić czynniki przypuszczalne. Przykładami są Agar Solny mannitolu zawierający 7% NaCl z 4 mg/l metycyliny lub 2 mg/l oksacyliny; Agar przesiewowy odporny na oksacylinę z 5,5% NaCl i 2 mg/l oksacyliną; Baird Parker Medium z 8 mg/l cyprofloksacyną; Agar Mueller Hinton z 4% NaCl i 6 mg/l oksacyliną. Czułość w inkubacji 24hrs jest zmienna z 48hrs inkubacji często wymagane dla akceptowalnego wyniku.
niedawno opracowane pożywki chromogenne łączą pierwotny wzrost i selektywność z różnicowaniem od gronkowców koagulazo-ujemnych. Media te wykazują lepszą specyfikę w porównaniu z mediami tradycyjnymi. Czułość jest również poprawiona, ale wymaga 48 godzin inkubacji, aby osiągnąć >85%.
większość metod molekularnych stosowanych do wykrywania MRSA jest wewnętrzna, opierając się na multipleksowanych starterach PCR wykrywających geny specyficzne dla S. aureus (nuc, fem) i mecA wykrywających oporność na metycylinę. Większość z nich nadaje się tylko do stosowania z czystymi kulturami, a nie do badań przesiewowych wymazów ze względu na obecność gronkowców koagulazo-ujemnych przenoszących Gen mecA oporny na metycylinę. Nowsze dostępne na rynku testy amplifikacji ukierunkowane na mecA w połączeniu z innymi specyficznymi markerami, takimi jak koagulaza i wykazały zachęcające wyniki
nastąpił szereg zmian w bioluminescencji, w szczególności zastosowanie kinazy adenylanowej (AK), enzymu występującego we wszystkich komórkach, które wytwarzają ATP z ADP. Pomiar AK jest bardziej czuły niż systemy oparte na ATP i umożliwia rutynowe wykrywanie 50 organizmów lub więcej w próbce. Wczesne dane dotyczące wydajności pokazują wyniki równoważne konwencjonalnym metodom hodowli płytkowej, zapewniając wyniki w ciągu 5 godzin.
Identyfikacja/potwierdzenie
tradycyjnie potwierdzenie S. aureus wykonuje się za pomocą testu koagulazy na szkiełku (współczynnik zlepiania) i testu koagulazy probówkowej (wolna koagulaza). Dodatnie wyniki testu koagulazy na szkiełku należy potwierdzić testem koagulazy rurkowej. Można również stosować płyty nośnikowe DNase, ale pozytywy wymagają dodatkowego potwierdzenia.
zestawy aglutynacyjne są powszechnie dostępne i mogą być używane do potwierdzenia S. aureus poprzez wykrywanie białka a i czynnika zlepiającego, chociaż niektóre szczepy MRSA mają niski poziom tych białek. Nowsze zestawy działają teraz poprzez wykrywanie antygenu powierzchniowego. Inne zestawy lateksowe wykrywają PBP2a, który występuje w błonie komórkowej i wymaga lizy komórek do wykrycia.
dostępna jest szeroka gama komercyjnych zestawów biochemicznych, zarówno ręcznych, jak i zautomatyzowanych. Są one oparte na tablicy badań biochemicznych dając profil oceniany na podstawie baz danych / tabel. Wiele zautomatyzowanych systemów łączy biochemiczną identyfikację S. aureus z panelami wrażliwości na antybiotyki w celu potwierdzenia MRSA.
metody badania wrażliwości na antybiotyki
metody badania wrażliwości na metycylinę i oksacylinę są obszerne, a opublikowane dane są sprzeczne z zaleceniami.
nie ma jednej metody, która byłaby odpowiednia dla wszystkich szczepów MRSA. Standardowe metody są publikowane przez British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC), a w USA Przez Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), wcześniej znany jako NCCLS.
minimalne stężenie hamujące metodą rozcieńczania tradycyjnie było metodą referencyjną.
BSAC zaleca stosowanie agaru Mueller Hinton lub Columbia z 2% NaCl i 104 cfu/ml inokulum inkubowanego w 30°C. CLSI zaleca Agar Mueller Hinton z 2% NaCl i 104 cfu/ml inokulum inkubowanego w 33-35°C.
metody molekularne, które wykrywają gen mecA, zastępują Mic jako metodę referencyjną.
badania wrażliwości na antybiotyki przy użyciu metod dyfuzji dyskowej pozostają najczęściej stosowane, ale na wyniki wpływa szereg czynników, w tym podłoże, stężenie NaCl, temperatura, inokulum i środek testowy.
wiele ostatnich badań z zastosowaniem metody dyfuzji krążków cefoksytyny sugeruje większą niezawodność niż w przypadku oksacyliny. Nie jest wymagane żadne specjalne podłoże ani temperatura inkubacji, a na badanie w mniejszym stopniu wpływa hiperproducent penicylinazy.
najnowszy suplement CLSI (M100-S14) sugeruje stosowanie dysków cefoksytyny 30µg z punktem przerwania<= 19 mm jako wskaźnik oporności S. aureus na oksacylinę. Inne metody oparte na mediach obejmują agar, metody punktu przerwania oparte na bulionie (2 mg/l oksacyliny, 4 mg/l metycyliny) i metody przesiewania agaru zalecane przez CLSI (zatwierdzony standard M7-A6).
MRSA nie jest już tylko infekcją nabytą w szpitalach, chociaż pozostaje głównym źródłem transmisji.
coraz częściej MRSA można nabyć we Wspólnocie, a nawet od zwierząt domowych . Być może jest to bardziej niepokojąca tendencja ze względu na potencjalnie dużą populację gospodarzy i podkreśla potrzebę znacznie zwiększonej kontroli sposobu i czasu stosowania antybiotyków.
powszechne podawanie antybiotyków poza znaczącymi klinicznie zastosowaniami może prowadzić jedynie do dalszej selekcji organizmów opornych na wyższe poziomy antybiotyków.
definicje: czym są patogeny ESKAPE?
często określane w mediach jako „superbugs”, patogeny ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.) są uważane za główną przyczynę zakażeń szpitalnych na świecie.
otrzymujesz najnowsze informacje o szybkich metodach badań mikrobiologicznych wysyłanych na twój e-mail? Subskrybuj darmowy rapidmicrobiology eNewsletter