cloreto de Lítio efetivamente mata uma abelha parasita Varroa destructor por um sistêmica do modo de ação
estudo Piloto: a Partir de RNAi para o cloreto de lítio
Em um estudo piloto, ácaros infestada de abelhas foram caged e alimentadas com xarope de sacarose contendo dsRNAs de potencialmente essenciais Varroa genes (Quadro Suplementar S1). Xarope de sacarose simples (não tratado) e xarope com dsRNA baseado na sequência de codificação da proteína verde fluorescente GFP (dsgfp ctrl) serviu como controlos. A GFP é expressa na água-viva bioluminescente Aequorea victoria. A sequência GFP foi escolhida como um controle porque não existe nenhum gene homólogo no genoma das abelhas melíferas ou do ácaro Varroa. No grupo não tratado, a mortalidade por ácaros foi<5%. Em contrapartida, todos os ácaros das abelhas que receberam uma solução de sacarose contendo dsRNA que visava os genes Varroa foram efectivamente mortos no prazo de três dias. Um efeito idêntico nos ácaros, no entanto, foi observado numa experiência de controlo em que as abelhas eram alimentadas com GFP dsRNA (Figo suplementar. S1). Estes resultados excluíram o mecanismo mediado pelo RNAi proposto, mas sugeriram um efeito ainda desconhecido do ARN ou a actividade de outros componentes na solução de ensaio. Como altas concentrações de cloreto de lítio (LiCl) foram usados na produção de dsRNAs e, portanto, alimentados para as abelhas, juntamente com o dsRNA, optou-se por alimentação de LiCl em solução de sacarose para caged abelhas para testar a sua actividade contra ácaros Varroa. Surpreendentemente, o LiCl, em concentrações de 25 mM, o que corresponde à concentração calculada na solução dsRNA, matou os ácaros tão eficazmente como as substâncias de ensaio que contêm dsRNA. Além disso, depois de LiCl ter sido em grande parte removido da dsRNA por lavagem extensiva (lavado dsGFP ctrl), A actividade misticida foi substancialmente diminuída como indicado pelo início tardio e actividade reduzida (Fig. suplementar. S1). A partir destes dados, concluímos que o LiCl, e não o RNA knockdown, mediou a actividade observada nos ácaros da Varroa e que valeria a pena analisar o potencial do LiCl como varroacide.
concentração efectiva de cloreto de lítio
para corroborar as observações primárias do nosso estudo piloto, estabelecemos experiências em gaiola com diferentes concentrações de LiCl para uma análise estatística robusta. Para além da concentração de 25 mM, que foi considerada eficaz no estudo-piloto, foram utilizadas concentrações de 2 mM, 4 mM e 10 mM para determinar o limiar inferior de eficácia. Os resultados apoiaram os achados do estudo anterior e demonstrou significativa miticidal efeitos de LiCl concentrações tão baixas como 2 mM em que um aumento substancial dos ácaros mortalidade (P < 0.001, teste log-rank; Quadro Suplementar S2) foi mostrado. Concentrações mais elevadas de 10 mM e 25 mM aumentaram significativamente a mortalidade de ácaros a partir do segundo dia de tratamento e atingiram o extermínio de mais de 96% dos ácaros tratados no final da experiência (Fig. Quadro S2). Nas experiências de controlo sem LiCl na solução alimentar, a mortalidade por ácaros atingiu, em média, 9,3%, situando-se, por conseguinte, bem dentro da Gama de taxas de mortalidade obtidas para os ácaros mantidos em abelhas em gaiolas não tratadas em diferentes condições ambientais 33. Com base nestes resultados, confirmamos um claro efeito de LiCl na ácaro viabilidade em um intervalo de concentração entre 2 mM e 25 mM.
a Mortalidade de phoretic ácaros Varroa e mel de abelhas após a alimentação de cloreto de lítio (LiCl) para caged abelhas. (a) de Kaplan-Meier curva de sobrevivência de mulheres ácaros Varroa mantidos em gaiolas abelhas alimentadas com LiCl em concentrações entre 2 mM–25 mM (n = 33, 9, 9, 12 e 9 gaiolas para 0 mM (controle), 2 mM, 4 mM, 10 mM e 25 mM, respectivamente). Em todas as concentrações, a sobrevivência dos ácaros nos grupos de tratamento foi significativamente diferente do controle (P < 0.001, teste log-rank com correção de Bonferroni). B) curva de sobrevivência Kaplan-Meier das abelhas operárias enjauladas e dos ácaros Varroa fêmeas após exposição a 24 horas (n = 9 gaiolas). A sobrevivência dos ácaros no grupo de tratamento foi significativamente diferente do grupo controle (P < 0.001, teste log-rank), mas não houve diferenças entre os grupos na mortalidade das abelhas.
Nos experimentos, o caged abelhas foram alimentados com a respectiva concentração de LiCl durante vários dias até que todos os ácaros foram mortos pelo tratamento. Contudo, para a utilização potencial na prática apícola, seria preferível um período de tratamento mais curto e definido. Por isso, realizámos uma experiência adicional, na qual a concentração mais eficaz de 25 mM LiCl (Fig. 1-A) foi administrado durante 24 horas, seguido de alimentação com solução de açúcar durante mais seis dias. No final do período de observação, 92.9% dos ácaros (n=225 ácaros, P < 0,001, teste log-rank) foram mortos sem qualquer efeito significativo nas abelhas tratadas (ver parágrafo seguinte). Este resultado demonstra claramente que mesmo uma alimentação a curto prazo de 25 mM LiCl é suficiente para diminuir substancialmente a população de ácaros.
Para determinar com precisão a quantidade ingerida de LiCl pelas abelhas, o que é necessário para matar parasitá ácaros, 12 recém-nascida abelhas foram alimentados artificialmente 10 µl de LiCl soluções de 4 mM a 100 mM e mantidos individualmente com um phoretic ácaro, por cinco dias dentro de gaiolas. Com 4 mM e 10 mM de soluções, o que correspondeu a uma absorção de 1,7 µg e 4,2 µg de LiCl, respectivamente, o efeito não foi significativamente diferente do controle não tratado (n = 12 ácaros, P = 1.000, teste log-rank, Quadro Suplementar e S3). No entanto, uma dose única de 25 mm, correspondente a 10, 6 µg de LiCl consumido pela abelha, foi suficiente para matar 100% dos ácaros fosforéticos em 48 horas (Fig. 2).
a Mortalidade de phoretic ácaros Varroa mantidos em abelhas que individualmente foram alimentados com 10 µl de uma solução de cloreto de lítio em concentrações que variam de 4 mM a 100 mM. As abelhas são alimentadas com LiCl apenas uma vez no início do experimento, em seguida, eles receberam sacarose, xarope de mais de cinco dias. Para cada concentração, foram analisadas 12 gaiolas com uma abelha e um ácaro Varroa cada uma. A sobrevivência dos ácaros foi significativamente reduzida em comparação com o grupo controle, quando as concentrações de 25 mM e superior foram alimentados para as abelhas (P < 0.001, teste log-rank).
efeito nas abelhas operárias
para a análise da tolerabilidade do LiCl às abelhas operárias, as gaiolas de ensaio utilizadas para analisar a mortalidade por ácaros (Fig. 1a) foram também registados para a mortalidade das abelhas operárias. Após exposição a 2 mM, 10 mM e 25 mM LiCl, que demonstraram exercer uma actividade misticida, a mortalidade das abelhas operárias tratadas variou, em média, entre 3% e 7% nos diferentes grupos de alimentação. Com excepção do grupo LiCl de 10 mM (n = 12 gaiolas, P = 0.015, teste log-rank; quadro suplementar S4), os valores não foram significativamente diferentes da mortalidade de 4% no grupo de controlo não tratado. Além disso, as taxas de mortalidade dos nossos controlos situavam-se bem dentro do intervalo de mortalidade das abelhas em gaiola não tratadas exigido como controlo nos testes toxicológicos 34, confirmando assim a validade do nosso sistema de testes. Além disso, o tratamento de 24 h com LiCl não afectou a mortalidade das abelhas operárias (Fig. 1b; n = 9 gaiolas, P = 0.308, teste de classificação logarítmica). Uma boa tolerabilidade do LiCl às abelhas foi também confirmada pela alimentação de uma dose única (para a mortalidade por ácaros ver Fig. 2) que não provocou um aumento significativo da mortalidade das abelhas operárias (P = 1000, teste log-rank; tabela suplementar S5).em seguida, as diferentes concentrações de LiCl foram continuamente alimentadas até à morte da última abelha enjaulada para investigar a resposta à exposição a longo prazo. Aqui, o tratamento reduziu significativamente o tempo médio de vida de recém eclodida abelhas operárias a partir de 26 de dias em que o controle não tratado gaiolas para 23 e 22 dias para 2 mM e 10 mM de LiCl, respectivamente (n = 60 abelhas, P = 0,024, teste log-rank; Quadro Suplementar S6). Nas abelhas que receberam a maior concentração de 25 mM de LiCl, o tempo de vida foi significativamente reduzido para 19 dias em média (Fig. 3a).
a Mortalidade das abelhas após a alimentação de cloreto de lítio para caged abelhas. a) curva de sobrevivência Kaplan-Meier das abelhas operárias enjauladas durante a exposição crónica ao LiCl. As dietas LiCl em concentrações de 2 mM, 10 mM e 25 mM foram alimentadas ad libitum até à morte da última abelha (n = 6 gaiolas com 10 abelhas cada). A sobrevivência de todos os grupos tratados foi significativamente diferente do controlo do xarope de açúcar (P < 0, 01, teste log-rank com correcção de Bonferroni). B) curva de sobrevivência de Kaplan-Meier das abelhas operárias enjauladas após uma exposição de 24 horas a LiCl. As dietas LiCl em concentrações de 2 mM, 10 mM e 25 mM foram alimentadas ad libitum durante as primeiras 24 horas após a eclosão e depois substituídas por xarope de sacarose (n = 12 gaiolas com 10 abelhas cada). A sobrevivência de todos os grupos tratados não foi significativamente diferente do controlo do xarope de açúcar (P > 0, 1, teste log-rank com correcção de Bonferroni).no entanto, o LiCl só parece impedir a viabilidade das abelhas se administrado durante um período prolongado, tal como indicado por uma experiência adicional em que o LiCl foi alimentado durante as primeiras 24 horas após a eclosão e foi substituído por xarope de sacarose até à morte da última abelha enjaulada (Fig. 3b). Aqui, a média de vida do recém eclodida abelhas operárias variou de 22 dias (10 mM) 24 dias (controle), sem diferenças significativas entre os tratamentos (n = 120 abelhas por tratamento, P ≥ 0.126, teste log-rank; Quadro Suplementar S7). Com base nestes dados das abelhas enjauladas, concluímos que mesmo um tratamento LiCl a curto prazo é suficiente para erradicar completamente a infestação de ácaros da Varroa com pouco ou nenhum impacto na viabilidade das abelhas operárias. Estes resultados obtidos em testes em gaiola em condições controladas representam um primeiro passo bem sucedido e promissor para uma nova abordagem do tratamento com Varroa. No entanto, a eficiência e os efeitos secundários devem ser confirmados em condições de campo.tests with lithium chloride in artificial swarms To approximate field conditions, we tested 25 mM and 50 mM LiCl in nine brood-free artificial swarms consisting of a queen and approximately 20,000 bees each. Estas concentrações foram escolhidas com base em experiências anteriores com abelhas enjauladas utilizando a dose mais elevada que ainda era tolerada pelas abelhas em períodos de Aplicação curtos (25 mM). Uma vez que uma distribuição uniforme de xarope de sacarose em todo o enxame artificial de aproximadamente 20.000 abelhas poderia ter sido difícil de conseguir, testamos adicionalmente uma concentração de 50 mM de LiCl para garantir que cada abelha fosse exposta a quantidades suficientes de lítio. Assim, os enxames foram alimentados ad libitum com xarope de sacarose contendo 25 mM LiCl (n = 6) ou 50 mM (n = 3) durante um período de três dias, seguido de uma aplicação tópica de Perizin®. O Perizin®, que contém o cumafos de organofosfato como substância activa, é um varroacide altamente eficaz que é frequentemente utilizado como tratamento de controlo35. A mortalidade por ácaros foi monitorizada durante um período de cinco dias. Antes do tratamento de controlo, o LiCl de 25 mM matou aproximadamente 90% dos ácaros presentes nos enxames artificiais (Quadro 1). A solução concentrada mais elevada (50 mM), no entanto, não aumentou este efeito (teste χ2, P = 0.953). No total, a eficácia foi um pouco menor em comparação com os testes em gaiola. Uma explicação pode ser que a distribuição de LiCl dentro de um cluster de milhares de abelhas requer mais tempo, até que o último indivíduo abelha consome uma dosagem suficiente para matar o respectivo parasitá ácaro. O tempo de alimentação necessário para essas enormes entidades de 20.000 abelhas e mais deve ser analisado em novas experiências.
a Eficácia de outros compostos de lítio e não-sais de lítio
Para confirmar lítio como o componente ativo para o efeito de ácaros Varroa testamos uma série de compostos de lítio e comparou o miticidal efeitos não-sais de lítio. De particular interesse foram citrato de lítio, um composto com três íons de lítio, sulfato de lítio e carbonato de lítio, que têm dois íons de lítio em comparação com apenas um íon de lítio em LiCl. Compostos adicionais com um ião de lítio (lactato de lítio, acetato de lítio), mas diferentes solubilidade, reactividade química e preço foram incluídos para analisar a eficácia e tolerabilidade em comparação com LiCl. Em experimentos em gaiola todos os compostos eliminados 100% dos ácaros a 25 mM em três (citrato de lítio e acetato de lítio) a quatro dias (sulfato de lítio, lactato de lítio e carbonato de lítio). Além disso, as soluções de teste de 4 mM, totalmente mortas ácaros fosforéticos em cinco dias (citrato de lítio, sulfato de lítio e acetato de lítio) a sete dias (lactato de lítio), exceto para carbonato de lítio (Tabela 2; Tabela suplementar S8).
Com estes experimentos nós poderíamos confirmar que outros compostos de lítio têm um potencial similar para o uso como um acaricida sistêmico. Isto pode aumentar a flexibilidade para a possível concepção de um produto veterinário. Considerando o preço, cloreto de lítio e citrato de lítio são os compostos mais baratos. O sulfato de lítio é menos adequado devido à menor tolerabilidade das abelhas e carbonato de lítio devido a uma relativamente baixa solubilidade em água.para investigar mais detalhadamente a eficácia dos compostos de lítio dependentes da concentração, comparámos LiCl com citrato de lítio (Li3C6H5O7), que teve a maior diferença no número de iões de lítio por molécula, em cinco concentrações diferentes numa gama de 1 mM-25 mM. Todas as concentrações de citrato de lítio exibiram uma actividade acaricida significativamente mais elevada em comparação com o LiCl, mas não houve diferença na mortalidade das abelhas (Tabela 3, tabelas suplementares S9 e S11). Portanto, citrato de lítio pode representar um ingrediente ainda melhor ativo.
Como uma bateria livre de controle e para a regra de cloreto como um agente ativo testamos também os sais alcalinos de cloreto de sódio (NaCl) e cloreto de potássio (KCl) e também o cloreto de magnésio (MgCl) a 25 mM. Nós não observamos um varroacidal efeito de NaCl ou KCl (n = 3 gaiolas, P = 1.000, teste log-rank, Quadro Suplementar S12). Em testes com MgCl, 100% das abelhas enjauladas morreram em cinco dias (P < 0.001, teste log-rank), e de acordo com a diminuição do número de abelhas, a experiência foi terminada antes de o efeito nos ácaros poder ser analisado. Com base nestes experimentos, concluímos que o lítio realmente media a atividade acaricida de uma forma dependente da dose e que o citrato de lítio exibe as propriedades mais favoráveis de todos os compostos testados até agora.
Potencial de compostos de lítio como novo varroacide
temos mostrado que não o inicialmente com a hipótese de double stranded Rna contra essencial Varroa genes, mas, surpreendentemente, lítio, sais de mediar uma forte acaricidal efeito de ácaros Varroa em caged abelhas e artificial de enxames. Assim, estes resultados mostram que os compostos de lítio representam uma nova classe de agentes acaricidas com um potencial excepcional e uma tolerabilidade notavelmente boa pelas abelhas. A diferente susceptibilidade dos ácaros e das abelhas ao LiCl é ainda mais notável, tendo em conta que, devido aos efeitos de diluição, a concentração de LiCl nas hemolinfas das abelhas será provavelmente substancialmente inferior à concentração alimentada pelas abelhas.
mportante, nossas descobertas não implicam que os efeitos acaricidas de abordagens baseadas em RNAi como publicado por Garbian et al.32 são geralmente mediados pelo LiCl. Depois de alimentar uma mistura de dsRNA para abelhas melíferas durante um período de 60 dias, Garbian et al.Registou-se um aumento lento da mortalidade por ácaros com uma eficácia final de tratamento de apenas 60%. Tendo em conta a resposta rápida e altamente eficaz dos nossos enxames artificiais aos tratamentos com LiCl, são prováveis diferentes modos de acção: enquanto os efeitos mediados pelo RNAi parecem exercer efeitos a longo prazo, os compostos de lítio representam um mecanismo independente com início rápido e elevada eficácia.como varroacida, LiCl apresenta algumas características únicas nesta combinação.: (i) LiCl atua de forma sistêmica, através de mel de abelha de alimentação (“fácil de aplicar”), (ii) é solúvel em água e, portanto, não irá se acumular em cera de abelha, que é um problema crucial para o tratamento a longo prazo conceitos usando sintético varroacides com lipofílico properties36,37 (iii) a toxicidade oral da maioria dos compostos de lítio para mamíferos é relativamente low38 (iv) não tem efeito repelente sobre a solução de alimentação dentro do respectivo intervalo de concentração de 2 a 25 mM39 e (v) ele está disponível a preços moderados. Altamente promissor é o facto de uma única aplicação de apenas 10 µl de LiCl numa solução de 25 mM (correspondente a uma dose de 10,6 µg de LiCl) por abelha individual ser suficiente para matar ácaros fosforéticos. Um desafio para mais pesquisas será o desenvolvimento de uma técnica de aplicação inteligente para enxames e colônias de tamanho integral para garantir que todas as abelhas recebem a quantidade crítica do composto ativo.atualmente, não sabemos como LiCl está matando os ácaros Varroa, e há poucas publicações sobre o efeito de LiCl em insects40. Na medicina humana, o lítio tem sido usado desde a década de 1870 e é um agente estabilizador do humor indicado para o tratamento de episódios maníacos e como tratamento de manutenção para a perturbação bipolar 41. Devido ao seu uso terapêutico, os compostos de lítio e o seu perfil de toxicidade foram cuidadosamente investigados. Até à data, um certo número de enzimas que actuam sobre o metabolismo, o desenvolvimento,a hematopoiese e outros processos foram propostos como potenciais alvos 42, 43. Estas enzimas requerem íons metálicos e o lítio exerce a sua actividade de uma forma não competitiva, o que provavelmente ocorre deslocando um catião divalente. Admittedly, we have currently no indication that the observed misticidal effect of lithium compounds relies on a comparable mode of action.também estamos conscientes de que os nossos resultados representam apenas o primeiro passo para o desenvolvimento de um novo produto veterinário. Os testes de campo em colónias voadoras livres são tão necessários como a análise dos efeitos secundários subletais e a longo prazo nas abelhas adultas e na ninhada de abelhas produtoras de mel e dos possíveis problemas de resíduos no mel.
no entanto,os resultados aqui apresentados já indicam que LiCl tem potencial como um tratamento eficaz e fácil de aplicar para enxames Artificiais e naturais e, particularmente, para o grande número de abelhas package utilizadas para a polinização nos Estados Unidos11, 44. Além disso, a elucidação do mecanismo de acção poderá abrir novas vias para o desenvolvimento orientado de Produtos Veterinários de combate aos ácaros da Varroa.