Monitorização precoce do tratamento da tuberculose por Xpert® MTB/RIF

aos editores: os progressos realizados para melhorar a capacidade laboratorial do diagnóstico da tuberculose (TB) levaram ao desenvolvimento de ensaios moleculares que estão agora a substituir métodos convencionais de microscopia e cultura baseados em larga escala . Infelizmente, as técnicas moleculares atuais detectam bactérias vivas e mortas, e um resultado positivo não implica a viabilidade do patógeno. Na verdade, o DNA pode persistir por um longo período após a morte bacteriana e o ácido nucleico de bactérias mortas é igualmente amplificável. Por conseguinte, os ensaios moleculares são inadequados para a monitorização do tratamento e/ou para o controlo de infecções.reportamos uma abordagem inovadora para amplificar selectivamente o ADN derivado de Mycobacterium tuberculosis viável em amostras clínicas, o que é útil para monitorizar a carga micobacteriana em doentes com tuberculose pulmonar durante o tratamento anti-TB.o protocolo baseia-se no pré-tratamento de amostras com monoazida de propídio (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, EUA), um composto químico que pode intercalar o ADN de organismos não viáveis (ou danificados pela membrana), mas é excluído de bactérias viáveis. Após a ativação da luz, o PMA liga-se covalentemente ao DNA, impedindo a sua amplificação por PCR . Após a exposição à luz, o PMA não ligado não é capaz de interagir mais com as moléculas de ADN.

O ensaio foi optimizado pela primeira vez utilizando amostras de bacilos acid-fast (AFB)-negativos enriquecidas com micobactérias mortas ou vivas em diferentes concentrações. Em resumo, as células vivas de Mycobacterium fortuitum foram adicionadas a amostras de sputum N-acetil-cisteína descontaminadas negativas para AFB por microscopia de esfregaço a uma concentração final de 106 bactérias * mL-1. Uma alíquota desta amostra feita em laboratório foi tratada para aquecer as células de M. fortuitum. A solução-mãe de PMA foi preparada e armazenada a -20°C e protegida da exposição à luz, até à sua utilização, conforme recomendado pelos fabricantes. Adicionou-se PMA como pré-tratamento a uma concentração final de 500 µM e incubou-se durante 30 minutos a 4°C no escuro, seguindo-se uma exposição da luz à luz azul Díodo emissor de luz (LED) – luz activa (GenIUL, Terrassa, Espanha) durante 15 minutos à temperatura ambiente. O DNA foi então extraído usando um procedimento padrão de clorofórmio fenol. Como um controlo para avaliar a eficácia da fase de exposição à luz, uma alíquota de ADN nu extraído de uma cultura de M. fortuitum foi tratada com uma PMA de 500 µM previamente exposta à luz LED durante 15 minutos. O ensaio com sonda comercial de linha (genótipo® Mycobacterium CM; Hain Lifescience, Nehren, Alemanha) foi então realizado a fim de identificar espécies micobacterianas clinicamente relevantes . Amostras contendo m vivo. fortuitum showed a normal hybridisation profile on a nitrocellulose strip, whereas samples treated to kill bacteria did not show any amplification, except for the internal control (data not shown). Uma vez que o ADN nu tratado com PMA inactivado pela luz mostrou um perfil de hibridação normal, a fase de exposição à luz foi eficiente e a PCR não foi mais inibida pela PMA residual.tendo optimizado o Protocolo para a inactivação do ADN derivado de bactérias mortas, adaptámo-lo ao ensaio automatizado Xpert® MTB/RIF (Cepheid, Sunnyvale, CA, EUA). A PCR em tempo real realizada pelo Xpert® MTB/RIF fornece limite de ciclos (Ct) que pode ser usada para calcular a diferença na amplificação de rendimento entre as amostras com e sem PMA pré-tratamento (ΔCt): uma baixa ΔCt indica a presença de DNA amplificável, a partir de bactérias vivas, enquanto que uma alta ΔCt indica que o alvo de DNA na amostra originou-se de morto ou danificado bactérias e, portanto, a PMA pré-tratamento afeta significativamente sua amplificação. Para calcular o valor ΔCt, considerámos a média entre os valores Ct fornecidos para cada sonda incluída no teste Xpert® MTB/RIF (A A E) .testámos o protocolo PMA utilizando o ensaio Xpert® MTB/RIF numa curva de calibração Ct de amostras clínicas AFB-negativas com micobactérias vivas / mortas pelo calor adicionadas em diferentes proporções. Razões elevadas de mortos-vivos resultaram numa diferença máxima nos valores ΔCt entre porções tratadas termicamente e vivas com PMA, enquanto amostras contendo uma percentagem semelhante de bactérias mortas e vivas não puderam ser diferenciadas umas das outras pelo uso de pré-tratamento PMA (dados não apresentados). Foram notificados dados semelhantes por Kralik et al. .finalmente, testamos a abordagem em amostras clínicas. No primeiro estudo de validação foram incluídos 10 doentes diagnosticados com TB pulmonar activa (positivo para esfregaço de sputum e positivo para cultura). As amostras foram recolhidas no momento do diagnóstico (t0) e após 10-20 dias de terapêutica (t1), N-acetil-cisteína descontaminada e processada para cultura líquida MGIT-960 (Sistemas de diagnóstico BD, Sparks, MD, EUA) de acordo com as directrizes internacionais . Todos os doentes ainda tinham AFB positivo por microscopia de esfregaço de sputum no t1. Em paralelo, 250 µL de amostras descontaminadas foram processadas para análise molecular pelo ensaio Xpert® MTB/RIF com e sem pré-tratamento PMA. As amostras foram então processadas de acordo com as instruções do fabricante para o ensaio Xpert® MTB/RIF.

Como mostrado na figura 1, a PMA não afetou significativamente PCR rendimento de espécimes coletados em t0 (média±sem ΔCt 2.3±0.5), enquanto que as amostras recolhidas durante a terapia em t1 mostrou um ΔCt de 10,5±0.9 após PMA tratamento (p=0,0003), confirmando que a baciloscopia positividade das amostras foi principalmente devido altamente danificado bactérias. Além disso, o ΔCt calculado entre t0 e t1 em amostras não tratadas com PMA foi considerado demasiado baixo (ΔCt 2, 9±0, 9) para apreciar uma diminuição real da carga bacteriana devido à terapêutica.

dois doentes classificados como “baixos” em t0 pelo Xpert® apresentaram uma cultura negativa em t1, enquanto que todos os outros doentes classificados como “médios” ou “elevados” permaneceram cultura positiva por MGIT. Embora um tempo exato para a positividade não possa ser avaliado, observamos que as culturas de amostras colhidas em t1 tornaram-se positivas aproximadamente 7-10 dias depois em comparação com culturas de amostras colhidas em t0, sugerindo uma redução grave na carga bacteriana viva.todos os doentes foram tratados e curados com sucesso no final da terapêutica, o que foi consistente com a redução de bactérias vivas detectada pelo doseamento de PMA.

Como um controlo negativo, nós retrospectivamente também incluímos um caso de falência do tratamento (AFB positivo e cultura positivo após 5 meses de tratamento padrão). Neste caso, o pré-tratamento de PMA de ambos os espécimes de sputum descontaminados colhidos ao fim de 1 mês e dois durante o tratamento não afetou significativamente o Rendimento da PCR (ΔCt ∼2), apoiando assim a ineficácia do tratamento anti-TB.o mesmo protocolo deve, em princípio, ser compatível com outros testes moleculares aprovados pela CE e ensaios de sonda endossados pela Organização Mundial de saúde para o diagnóstico da tuberculose; são necessários mais estudos para excluir esta possibilidade.estudos anteriores demonstraram a possibilidade de utilizar PMA para distinguir entre micobactérias vivas e mortas utilizando uma concentração de 25-50 µM. Durante o estabelecimento do protocolo, foi observada uma concentração final de 100 µM totalmente evitada a amplificação do ADN derivado de M. fortuitum morto pelo calor; foi observado um fundo fraco devido à amplificação do ADN do M. tuberculosis morto pelo calor (dados não apresentados). Podemos especular que a diferente composição da parede celular de alguma forma afeta a capacidade de PMA de penetrar micobactérias danificadas. De facto, Kralik et al. observou-se que a redução do sinal induzida por PMA entre Mycobacterium avium subsp vivo e morto. a paratuberculose foi menor em comparação com as encontradas para outras espécies bacterianas. Além disso, considerando a quantidade de detritos que poderiam potencialmente sequestrar moléculas de PMA em sputa descontaminada, aumentamos a concentração final para 500 µM. Outros estudos avaliam as diferenças do efeito do tratamento de PMA nas estirpes que apresentam diferentes composição da parede celular (por exemplo, estirpes de Pequim) e/ou em sputa com diferentes características (por exemplo, estirpes de Pequim). pode elucidar melhor a utilidade deste teste em diferentes contextos clínicos.

de acordo com LØvdal et al. , uma pequena proporção de células presumivelmente mortas ou gravemente feridas não são capazes de crescer. A presença de um pequeno número de células gravemente feridas, mas não culturáveis, pode explicar por que razão ainda temos um sinal positivo em amostras colhidas em t1, apesar do pré-tratamento PMA. O pré-tratamento de PMA não evita a detecção de uma pequena proporção de células mortas (falso positivo para um ensaio de viabilidade).: o teste pode, portanto, sobrestimar micobactérias viáveis. No entanto, do ponto de vista clínico, isso representaria um erro menor em comparação com o risco (muito pequeno para este teste) de subestimar mycobacteria viável.os nossos dados indicam, pela primeira vez, que as técnicas moleculares quantitativas combinadas com o método PMA podem ser uma alternativa à microscopia e cultura directas para monitorizar a resposta precoce ao tratamento e para a avaliação preliminar de regimes personalizados. O uso deste ensaio pode permitir uma avaliação prévia da eficácia do tratamento, mostrando uma clara diminuição da carga vital de micobacterianos. No entanto, a ausência de resposta à terapêutica também pode ser prontamente identificada pelo teste, permitindo uma alteração do regime e limitando a propagação da infecção e o desenvolvimento de resistência adicional .a investigação conducente a estes resultados recebeu financiamento do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (7.º pq/2007-2013) ao abrigo da Convenção de subvenção 7. º pq-223681 concedido a D. M. Cirillo.Declaração de Interesse não declarada.

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