the Embryo Project Encyclopedia

de 1958 a 1961, Leonard Hayflick e Paul Moorhead nos EUA desenvolveram uma forma no laboratório de cultivar estirpes de células humanas com conjuntos completos de cromossomas. Anteriormente, os cientistas não podiam manter culturas celulares com células que tinham dois conjuntos completos de cromossomas, como células humanas normais (diplóides). Como resultado, os cientistas tentaram estudar biologia celular humana porque não havia uma fonte confiável de células que representavam células humanas diplóides. Nos seus experimentos, Hayflick e Moorhead criaram estirpes duradouras de células humanas que mantiveram ambos os conjuntos completos de cromossomas. Eles então frozesamples das culturas para que as células permanecessem viáveis para a futura pesquisa. Eles também notaram que as células poderiam dividir apenas um certo número de vezes antes de se degradarem e morrerem, um fenômeno latercalled o limite Hayflick. A experiência de Hayflick e Moorhead permitiu a pesquisa de biologia do desenvolvimento e vacinas que se baseavam em estirpes humancell.

Hayflick specialized in culturing cells in controlledenvironments. Em 1958, ele se juntou ao Instituto Wistar na Filadélfia,Pensilvânia, uma instituição de pesquisa que estudou biologia celular e vírus, a convite do novo diretor do Instituto, HilaryKoprowski. Koprowski encarregou Hayflick de criar culturas celulares para uso nas experiências de outros pesquisadores do Instituto. Hayflicklater lembrou, no entanto, que ele usou sua tarefa de pesquisa como uma oportunidade para estudar os métodos e limitações das culturas celulares. Toassist in culturing cells, Hayflick recruted his Wistar colleague, Paul Moorhead, who studied the structure and function of cells andchromosomes. a falta de longevidade das culturas normais de células humanas nas investigações laboratoriais limitadas que os cientistas poderiam fazer. Com células, os cientistas crescem populações de células em material de vidro em condições controladas para uso em pesquisa. Pesquisadores tipicamente cultivam culturas de células em placas de vidro ou Petri que contêm meio de crescimento,uma solução contendo sais dissolvidos, açúcares e outros nutrientes. Ao longo da primeira metade do século XX,pesquisadores colocaram a hipótese de que todas as culturas normais e saudáveis de células tinham uma capacidade inata de dividir indefinidamente com base nos achados anteriores publicados pelo biólogo Alexis Carrel em 1912 nos EUA. Na prática,porém, os pesquisadores não observaram divisão infinita em células normais.Em vez disso, as células da cultura eventualmente degradaram-se e morreram. Os cientistas argumentaram que as células se degradaram por terem esgotado o meio de cultivo de todos os seus nutrientes ou por os técnicos de laboratório não terem conseguido manter as condições ambientais ideais para o crescimento celular. As únicas células humanas que se dividiam continuamente em ambientes de trabalho, chamadas linhas celulares imortais, eram células derivadas de células cancerosas. Estas linhas celulares representavam apenas alguns aspectos da biologia celular humana.

Em meados do século xx, medicalresearchers não poderia explicar o que causou o câncer, e muitos cientistas,incluindo Hayflick e Moorhead, a hipótese de que certos virusesmight causar crescimento canceroso. Embora muitos microbiólogos tenham utilizado células derivadas de linhas celulares cancerosas na investigação médica, as células não eram geralmente utilizadas no desenvolvimento de vacinas porque os cientistas receavam que as vacinas estivessem contaminadas com vírus causadores de cancro possivelmente contidos nas próprias células. Além disso, as células de linhas cancerosas, devido à sua constante, eram heteroplóides, o que significa que tinham um maior ou menor número de cromossomas do que as células humanas normais, que têm dois conjuntos completos de cromossomas. As células heteroplóides muitas vezes resultaram da divisão celular contínua ao longo de muitas gerações de células incultas.

Hayflick e Moorehead produzidas as células humanas que poderia becultivated ao longo de muitas gerações, como a partir de células cancerosas celllines, mas também preservou as células diplóides número de cromossomos andreduced o risco teórico de causar câncer vírus. Theydescribed their experiment in “the Serial Cultivation of Human DiploidCell Strains,” published in 1961.

Hayflick e Moorhead procuraram desenvolver estirpes de células humanas que poderiam ser cultivadas durante longos períodos de tempo no laboratório, mas ainda mantiveram o seu número diploidnúmero de cromossomas. Eles colocaram a hipótese de que se eles fossem trocados pequenas amostras de células humanas diplóides de culturas já em crescimento para um novo ambiente de crescimento, eles aumentariam muito o número de células diplóides na cultura. Hayflick e Moorhead propuseram que congelar pequenas quantidades de células diplóides iria pausar o crescimento e a divisão de celulite sem matar as células. As células congeladas poderiam então ser armazenadas até que os investigadores as exigissem, altura em que podiam ver as células congeladas, restaurando-as à actividade celular normal.Hayflick e Moorhead previram que após a descongelação, as células cultivadas não se tornariam células heteroplóides como as de outras linhas e manteriam o seu conjunto diplóide de cromossomas.

Hayflick e Moorhead’sexperiment destinado para tanto, criar um método para o crescimento humano diploidcells no laboratório de investigação de longo prazo com o uso, e determinewhether ou não de células de linhagens contribuiu para o crescimento canceroso.Hayflick e Moorhead primeiro cresceu células humanas em laboratório growthcultures, transplantados de pequenas amostras de células em novas embalagens togrow adicionais culturas de células, e congelou amostras de células de thosecultures para preservar as células para posterior investigação. Em seguida, para testar se as células congeladas ainda eram viáveis para pesquisa, Hayflick e Moorhead proibiram as células congeladas e tentaram cultivar culturas celulares a partir delas.Finalmente, eles implantaram amostras dessas estirpes de células diplóides humanas em tecidos vivos para ver se eles levaram a crescimentos cancerosos.

para desenvolver estirpes de células humanas, Hayflick e Moorhead começaram a cultivar células de 25 tecidos diferentes obtidos a partir de fetos abortados. Thosecells became 25 different human cell strains, named numerically WI-1 through WI-25. O WI representava o Instituto Wistar, onde as cellstrains foram desenvolvidas. O feno e o Moorhead utilizaram tecidos fetais porque, mais do que as células adultas, as células fetais desenvolveram-se mais rapidamente em células fibroblastas, que são células especializadas que fornecem apoio estrutural à maioria dos tecidos corporais. As células fibroblastasforam preveníveis para o cultivo de células de laboratório porque cresciam rápida e continuamente em culturas celulares, proporcionando uma abundância de células para a investigação. O Hayflick e o Moorhead cortaram cada uma das amostras de tecido em grande escala, lascas finas e depois implantaram-nas na parede interna das vidraças cheias de meio de crescimento rico em nutrientes. Hayflick e Moorheadthen colocaram os frascos revestidos de tecido de cada estirpe de células num ambiente quente durante três dias, substituindo regularmente o meio de crescimento por um novo fornecimento, para começar a crescer a cultura de células. Hayflick Andmoorhead permitem que as culturas cresçam até as células revestirem todo o manto de vidro. Cada amostra de células fetais foi então subdividida por uma subcultivação de processo. Durante a subcultivação, Hayflick e Moorheadrevelaram uma pequena amostra de células e implantaram essas células na parede de uma nova garrafa de vidro cheia de meio de crescimento, criando uma nova cultura de células da mesma estirpe. Cada nova cultura de células constitui uma nova geração de células que poderiam ser subcultivadas pelo mesmo método, permitindo que o número total de células crescesse exponencialmente. Hayflick e Moorhead dividiram então amostras das células restantes em pequenas porções e congelaram-nas para pausar o crescimento das células e interromper qualquer outra divisão celular.

Hayflick and Moorheadcontinued subcultivating cells twice a week for about ten months, at which point the cell cultures stopped growing and began to degrade.Hayflick e Moorhead sugeriram que as células tinham deixado de dividir devido à acumulação de produtos tóxicos do crescimento celular no meio de crescimento. Hayflick e Moorhead tentaram introduzir um growththmedium fresco que estava livre de quaisquer toxinas possíveis, mas a cultura celular continuou a degradar-se e morrer ao longo dos próximos meses. No entanto, outras culturas celulares colocadas no mesmo meio de crescimento não degradaram e morreram. Os investigadores concluíram que algo sobre as próprias células, e não sobre o seu ambiente, os fez começar a deteriorar-se.

Hayflick e Moorhead próxima tentativa para determinar se ou não thecells que eles tinham congelado pode ainda ser utilizado para crescer mais cellcultures. Depois de descongelar pequenas amostras de células, Hayflick e Moorheadimplantaram as células nas paredes dos frascos de vidro. Eles novamente os cultivaram em meios de crescimento e descobriram que, mesmo após o descongelamento, as células ainda cresciam em novas culturas, o que poderia ser subcultivado. Independentemente de anteriores congelações ou subcultivações,os investigadores podem utilizar amostras de culturas de células humanas diplóides para crescerem mais culturas de células humanas diplóides. Hayflick e Moorhead criaram uma estirpe adiplóide de células humanas que poderia ser cultivada em culturas de laboratório indefinidamente.

Hayflick and Moorhead then investigated whetheror not the cells grown in the new cultures were diploid. Ao escrever sobre o experimento, eles disseram que estavam preocupados que as células podem não ter permanecido diplóides porque elas as tinham cultivado ao longo de muitas gerações, o que pode levar à heteroploidia. Usando microscópios de luz, Hayflick e Moorhead analisaram amostras de células durante a metafase da divisão celular, quando os cromossomas são distintos e facilmente vistos. Eles contaram o número de cromossomas em 250 células individuais para obter uma estimativa de quantas células ainda tinham número adiplóide de cromossomas. Hayflick e Moorhead determinaram que mais de 97 por cento das células eram diplóides mesmo depois de mais de twentigenerações de subcultivação. Hayflick e Moorhead concluíram que o seu processo de cultivo em série e congelação de células fetais era um método eficaz para preservar uma estirpe diplóide de células humanas. finalmente, o Hayflick e o Moorhead precisavam de mostrar que as suas estirpes celulares não provocavam cancro. O problema com as linhas de células imortais criadas a partir de células cancerosas foi que os investigadores colocaram a hipótese de que as células podem conter vírus causadores de cancro. A fim de garantir que as suas estirpes newcell não causassem cancro, Hayflick e Moorhead testaram a estirpe das células Wi-25 no tecido vivo. Eles selecionaram o strainbec porque ele tinha sofrido a maioria das subdivisões e era a estirpe mais provável deell para causar câncer. Por conseguinte, se não o fizesse, era provável que nenhuma das outras estirpes o fizesse. os investigadores implantaram células da estirpe das células WI-25 nas bochechas de cinco livinghamsters. Como um grupo experimental de controlo, também implantaram cinco bolsas de bochecha de outros hamsters com células derivadas de linhagens cancerosas. No início, nódulos, um sinal precoce de desenvolvimento de câncer, appearredn os sacos de controle de ambos os conjuntos de hamsters. No entanto, após três semanas, quase todos os nódulos nos hamsters implantados com o WI-25cells tinham desaparecido, enquanto os nódulos nos hamsters implantados com células cancerosas linhas tinham todos aumentado em tamanho. Hayflick e Moorhead realizaram biópsias dos nódulos restantes para confirmar a sua previsão de que as suas células subcultivadas não causaram cancro.As biópsias mostraram que os nódulos nos hamsters implantados com células de linhas celulares cancerosas eram, de fato, cancerosos, enquanto as células WI-25 eram devido a inflamação e sangramento no implantationite.

Hayflick e Moorhead também implantaram um grupo celular humano semelhante, o WI-1, nos tecidos musculares de cinco doentes com cancro a morrer.Ele também implantou células de linhas celulares cancerosas em cinco outros pacientes com câncer terminal. Como nos hamsters, no início os nódulos prendiam os locais de implantação de ambos os grupos. Após alguns dias, os nódulos celulares Wi-1 começaram a diminuir, enquanto os nódulos se multiplicaram em pacientes implantados com células de linhas celulares cancerosas. No final de uma semana, quase todos os nódulos WI-1 tinham desaparecido, e Hayflick e Moorhead biopsiaram os restantes nódulos em ambos os grupos. Os resultados das biópsias mostraram que os nódulos celulares cancerosos eram células heteroplóides, enquanto os nódulos WI-1 eram diplóides e não cancerígenos. As descobertas de Hayflick e Moorhead, que publicaram em 1961, demonstraram que as células diplóides humanas poderiam ser propagadas ao longo de muitas gerações,como linhas celulares cancerosas, sem se tornarem heteróplóides ou cancerosas. os resultados tiveram um impacto imediato e duradouro na compreensão da biologia do desenvolvimento e da investigação científica. Os resultados da sua experiência confirmaram a hipótese de 1912 de Carrel de que as células normais cresciam indefinidamente na cultura, apesar das observações das culturas de células se degradarem ao longo do tempo. Carrel tinha sugerido que a razão de que as células, na prática, parecia deteriorar-se e idade horas extras foi devido às condições imperfeitas de crescimento laboratorial para as células.Carrel alegou que, em condições ideais, as células em culturas podiam dividir indefinidamente, efetivamente atuando como uma linha celular imortal.Os achados de Hayflick e Moorhead, no entanto, indicaram que o envelhecimento dos organismos ocorre em um nível celular, um processo chamado senescência,e que as células só poderiam passar por um número limitado de divisões antes que elas se degradassem e morressem. Durante sua experiência, Hayflick e Moorhead tentaram continuamente a cultura de células fetais, substituindo o velho growththmedium por meio fresco e rico em nutrientes. No entanto, eles descobriram que depois de cerca de quarenta ou sessenta gerações, as células começaram a morrer em vez de se reproduzir, um fenômeno mais tarde chamado de limite Hayflick. Este resultado demonstrou que as células não podiam crescer indefinidamente na cultura, mesmo em condições ideais.

Hayflick and Moorhead’s method of serial cultivation of human diploid cells also helped scientists to maintain an abundant supply of diploid human cells for research. ByHayflick and Moorhead’s calculations, a single human cell strain could be subcultivated enough times to produce nearly 20 Metric tons ofviable cells. Apesar de não ser tecnicamente imortal, essa oferta seria inesgotável para fins de investigação prática. além disso, a criação de células humanas diplóides viáveis permitiu a investigação da vacina.Uma vez que o Hayflick e o Moorhead demonstraram que as suas estirpes de células humanas não causaram cancro em hamsters ou em seres humanos, essas estirpes podem ser utilizadas em vacinas sem ameaça de contaminar a vacina com um agente causador de somecancer. As subsequentes estirpes de células humanas derivadas de forma semelhante, como o WI-38, tornaram-se a base para as vacinas para doenças infantis como a rubéola e a varicela. enquanto muitos pesquisadores saudaram o desenvolvimento de estirpes de células humanas por Hayflick e Moorhead, alguns, incluindo a Igreja Católica, desaprovaram o uso de fetalmaterial abortado no desenvolvimento de vacinas por motivos religiosos. A Vatican declarou mais tarde que se opunha ao método de desenvolvimento de vacinas derivadas de tecidos fetais, e não à utilização individual destas vacinas para prevenir doenças.

Hayflick e Moorhead demonstratednot só que as células humanas pode ser cultivada com êxito em thelaboratory mantendo ainda um número diplóide de cromossomos,mas também que pudessem manter as células quase indefinitelythrough série subcultivation. Além disso, sua experiência estabeleceu a Fundação para Hayflick para investigar mais o limite de divisão celular na cultura, mais tarde chamado de limite Hayflick. As descobertas de Hayflick e Moorhead permitiram a realização de mais experiências no desenvolvimento da biologia e do desenvolvimento de vacinas, fornecendo abundantes células humanas para a investigação.