> Vantagens e limitações da tecnologia de microarray em humanos câncer

Em abril deste ano, assistimos a um dos mais monumentais realizações em biologia: o completo seqüenciamento do genoma humano. A decodificação e deposição de banco de dados de bilhões de bases de sequência é o ponto de partida da genômica funcional pós-sequência. A descoberta da Tabela Periódica teve um impacto importante na química. Também assim, a decifração completa do genoma humano terá efeitos impressionantes na saúde humana e na qualidade de vida. Atualmente, entendemos a função de apenas um número limitado de genes humanos. Estudar todas as funções dos genes humanos é um desafio tecnológico. Para enfrentar este Desafio, foram desenvolvidas novas ferramentas de alta capacidade. O ensaio de microarray é uma poderosa tecnologia molecular que permite o estudo simultâneo da expressão de milhares de genes ou dos seus produtos RNA, dando uma imagem precisa da expressão genética na célula ou na amostra no momento do estudo.

Por exemplo, a expressão de todos os genes para a resistência ao fármaco e metabolismo ou todos os oncogenes conhecidos numa célula podem ser detectados e medidos no mesmo período de tempo (Brown e Botstein, 1999; Collins, 1999; Lander, 1999). O microarray pode ser definido como uma coleção ordenada de microspots (as sondas), cada ponto contendo uma única espécie de ácido nucleico e representando os genes de interesse. Esta tecnologia é baseada em hibridação entre alvos livres rotulados derivados de uma amostra biológica e um conjunto de muitas sondas de DNA que são imobilizadas em uma matriz (Southern et al., 1999). Os alvos são produzidos por transcrição reversa e a rotulagem simultânea de extratos de RNA de uma amostra biológica hibridizada com sondas de fragmentos de DNA. O sinal de hibridação produzido em cada sonda é o nível de expressão de mRNA do gene correspondente na amostra no momento do estudo. Os sinais são detectados, quantificados, integrados e normalizados com um software específico e reflectem o “perfil de expressão genética” ou “retrato molecular” para cada amostra biológica.muitos milhares ou dezenas de milhares de pontos distintos podem ser impressos em uma lâmina de silício ou vidro ou uma base de nylon no estado sólido. Existem principalmente duas variantes de microarrays: cDNA e microarrays oligonucleotide (Schena et al., 1995, 1996; Lockhart et al., 1996). Embora ambos os tipos de microarray sejam usados para analisar padrões de expressão genética, estas variantes são fundamentalmente diferentes (Lipshutz et al., 1999). Em microarrays cDNA, moléculas de DNA relativamente longas são imobilizadas em uma superfície sólida. Este tipo de microarray é usado principalmente para pesquisas em larga escala e estudos de expressão. O microarray oligonucleotídeo é fabricado por síntese química dirigida à luz in situ ou por síntese convencional seguida de imobilização numa matriz de vidro. Este microarray é usado para a detecção de mutações, mapeamento de genes e estudos de expressão e permite a detecção diferencial de membros da família de genes ou transcrições alternativas que não são distinguíveis por microarrays cDNA.

a química do microarray em si não é nova, uma vez que a tecnologia de hibridação tem sido bem estabelecida por décadas. No entanto, o estudo simultâneo de milhares de genes transforma a técnica de microarray em uma poderosa ferramenta analítica de todo o sistema. Quase 10 anos se passaram desde que os primeiros microarrays foram criados, e ainda assim esta tecnologia ainda está melhorando e avançando. Desde a sua introdução inicial, o número de aplicações de microarray expandiu-se (Figura 1). A partir do seu uso no rastreio de genes e na identificação de alvos, esta tecnologia está a encontrar novas aplicações, tais como biologia do desenvolvimento, classificação de Doenças, Estudos de vias, descoberta de medicamentos e Toxicologia. A tecnologia envolvida na produção e utilização do microarray está fora do âmbito desta revisão, mas foi amplamente revista noutros locais (Schena et al., 1995; Niemeyer e Blohm, 1999; Bowtell, 1999; Brown e Botstein, 1999; Celis et al., 2000; Cheung et al., 1999; Duggan et al., 1999; Graves, 1999; Khan et al., 1999; Hegde et al., 2000; Meldrum, 2000). Descrevemos aqui alguns dos recentes desenvolvimentos e resultados em tecnologia de microarray em pesquisa de câncer, discutir problemas potenciais, descrever aplicações clínicas e comentar sobre o futuro desta tecnologia.

Número de citações encontradas nas bases de dados MEDLINE através da inserção de ‘microarray’ (barra cinza) ou “microarray+cancro” (barra branca) para uma base de dados PubMed de pesquisa. Artigos, que foram publicados entre 1995 e 2002

A importância de medir global de expressão gênica em cânceres humanos

Caracterizar a população de genes transcritos levou à criação de um novo termo, o transcriptoma (Su et al., 2002). Este conceito define o conjunto completo de genes transcritos expressos como RNAs mensageiro para uma determinada espécie. O transcriptoma, portanto, representa o universo de mensageiros RNA que podem codificar proteínas. Apenas cerca de 5% dos genes são activos numa determinada célula num dado momento. A maioria dos genes são reprimidos, e este controle pode ocorrer no nível transcritional ou translacional. Uma vez que a regulação da expressão proteica ao nível da transcrição é mais eficiente, A maior parte do controle ocorre a este nível. O perfil de expressão genética de uma célula determina a sua função, fenótipo e resposta a estímulos externos. Portanto, os perfis de expressão genética podem ajudar a elucidar funções celulares, vias bioquímicas e mecanismos regulatórios. Além disso, os perfis de expressão genética das células/tecidos da doença, em comparação com os controlos normais, podem promover a compreensão da patologia da doença e identificar novos pontos terapêuticos de intervenção, melhorando o diagnóstico e clarificando o prognóstico.

durante os últimos anos, vários métodos de análise de expressão genética surgiram e foram aplicados com sucesso na pesquisa do cancro. Estes incluem exibição diferencial, análise em série da expressão genética e microarrays (Velculescu et al., 1995; Granjeaud et al., 1999; Cheng et al., 2002). Os microarrays tornaram-se importantes porque são mais fáceis de usar, não requerem sequenciamento de DNA em grande escala e permitem a quantificação paralela de milhares de genes de múltiplas amostras. O perfil de expressão genética de cancros representa a maior categoria de pesquisa usando tecnologia de microarray e parece ser a abordagem mais abrangente para caracterizar o câncer molecular. Embora o fenótipo do câncer seja apenas parcialmente determinado por seu transcriptoma, ele ainda fornece uma imagem clara do estado fisiológico de uma célula. O poder desta abordagem foi demonstrado em estudos realizados com uma grande variedade de doenças malignas, incluindo cancros da mama, cabeça e pescoço, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, próstata e estômago (Bhattacharjee et al., 2001; Dhanasekaran et al., 2001; Garber et al., 2001; Tonin et al., 2001; Al Moustafa et al., 2002; Belbin et al., 2002; Chen et al., 2002; Han et al., 2002; Hedenfalk et al., 2002; Hippo et al., 2002; Luo et al., 2002a).

Vários estudos de câncer de criação de perfil por microarray analysis têm utilizado diferentes estratégias, tais como tumor versus controlo, em que o tumor gene do perfil de expressão é comparado com o seu correspondente controle de amostra, a fim de medir as diferenças e semelhanças entre os dois fenótipos, câncer de estratificação, em que os perfis de expressão gênica a partir de diferentes amostras do mesmo tipo de câncer são comparados para revelar diferentes subgrupos para melhor definir a tipificação molecular de um tipo histológico de câncer, e, finalmente, a avaliação temporal do tumor, em que o gene padrões de expressão de amostras de tumor derivadas de diferentes estágios de progressão são comparados para elucidar as diferenças entre os estágios inicial e avançada da doença. Embora tenham sido publicados muitos estudos de análise de microarray em doenças humanas, apresentamos aqui alguns dos que têm um interesse clínico pela oncologia.

Microarray e cancro da próstata

vários estudos que utilizaram microarray para caracterizar os perfis de expressão do gene do cancro da próstata foram recentemente publicados. Estes estudos têm usado a tecnologia de microarray como uma ferramenta de descoberta de genes para identificar marcadores genéticos que discriminam entre tecidos da próstata normais e cancerosos. Foi realizado um estudo simples de microarray utilizando matrizes de membrana manchada para analisar tecidos e linhas celulares normais e cancerosas (Bull et al., 2001). Os resultados do microarray de membrana são limitados pela insensibilidade relativa desta técnica para detectar transcrições expressas em níveis baixos e o pequeno número de pontos que podem ser colocados nas membranas.; no entanto, este estudo produziu marcadores candidatos de câncer de próstata para avaliação adicional. Cinco estudos publicados analisaram perfis de expressão genética em vários milhares de genes em tecidos normais e próstata e utilizaram análises hierárquicas de agrupamento não supervisionadas para classificar espécimes (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001A; Singh et al., 2002). Dhanasekaran et al. (2001) foram capazes de distinguir a próstata normal, hiperplasia prostática benigna (BPH), câncer de próstata localizado e amostras de câncer de próstata metastático usando 9.984 microarrays com manchas elemento. Utilizando a análise hierárquica de agrupamento, Luo et al. (2001) were able to discriminate 16 Próstata cancer samples from nine BPH specimens on the basis of differences in gene expression profiles as measured on 6.500 element-spotted cDNA microarrays. Welsh et al. (2001a) reported a similar separation of normal and malignant próstata tissue samples using oligonucleotide microarrays. Curiosamente, todos os cinco grupos identificaram a protease da serina transmembranar hepsin como apresentando um aumento significativo da expressão em tecidos malignos, em comparação com o tecido normal da próstata (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001A; Singh et al., 2002). Muitos outros marcadores candidatos do câncer de próstata, como o proto-oncogeno PIM1, emergiram de outros estudos e estão sendo investigados como potenciais marcadores diagnósticos. A expressão diminuída PIM1 na imunohistoquímica de amostras de tumores da próstata conferiu um risco aumentado de recorrência após cirurgia (Dhanasekaran et al., 2001). Outros grupos usando combinações de hibridação subtractiva e análise de microarray identificaram vários potenciais candidatos para a terapia imunomodulatória do câncer de próstata, incluindo prostein (Xu et al., 2001), STEAP (Hubert et al., 1999) e p504S / Alfa-Metilacil-CoA-Racemase (Jiang et al., 2001). Num estudo muito recente, Virolle et al. (2003) used a próstata cancer cell line that expresses a high constitutive level of Egr1 protein, a transcription factor overexpressed in the majority of aggressive tumorigenic Próstata cancer cells. Avaliaram a regulação transcritional do Egr1, através da realização de uma análise de microarray oligonucleotídeo utilizando células consideradas deficientes em Egr1 como amostra de comparação para a identificação dos genes-alvo do Egr1. Pela primeira vez nos tecidos da próstata, este estudo confirmou o papel potenciador do crescimento do Egr1 anteriormente observado em outros sistemas celulares, e identificou vários novos genes-alvo que controlam especificamente o crescimento, a progressão do ciclo celular e as vias apoptóticas.até à data, apenas foram publicados alguns estudos de microarray relevantes para o cancro oral. Chang et al. (1998) illustrated the use of cDNA microarrays to characterize transformation-related genes in oral cancer. Villaret et al. utilizou uma combinação de subtracção complementar de ADN e análise de microarray para avaliar genes únicos específicos para o carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC) como potenciais marcadores tumorais e candidatos à vacina. Verificou-se que nove genes conhecidos estavam significativamente sobreexpressos no HNSCC em comparação com o tecido normal. Além disso, quatro novos genes foram sobreexpressed em um subconjunto de tumores (Villaret et al., 2000). Alevizos et al. (2001) analisou o transcriptoma em carcinoma de células escamosas da cavidade oral. Eles encontraram cerca de 600 genes candidatos (oncogenes, supressores tumorais, fatores de transcrição, marcadores de diferenciação, proteínas metastáticas e enzimas xenobióticas) que foram expressos diferentemente no câncer oral, validando apenas três desses genes por PCR.

Lu et al. (2001) used the microarray approach to evaluate gene expression profile changes during the initiation and progression of squamous cell carcinoma of the esophagus. Examinaram perfis de expressão genética em diferentes fases do início e progressão do cancro esofágico, a fim de identificar genes diferentes expressos entre essas fases. Frierson et al. (2002) used oligonucleotide microarray analysis to study the expression of 8.920 different human genes in 15 adenoid cystic carcinomas (ACCs), one Acc cell line and five normal major salivary glands. Entre os genes com expressão alterada em ACC estavam os que codificam os fatores de transcrição SOX4 e AP – 2 Gama, caseína kinase 1, bem como epsilon e frizzled-7, ambos membros da via de sinalização Wnt/beta-catenina. Num estudo muito recente, Leethanakul et al. (2003) generated high-complexity cDNA libraries from laser capture microdissected normal and cancerous squithelium. Neste estudo, os autores pesquisaram a informação de sequência disponível usando ferramentas bioinformáticas e identificaram 168 novos genes diferentes expressos em epitélio normal e maligno. Além disso, usando matrizes de cDNA, eles obtiveram evidências de que um subconjunto destes novos genes pode ser altamente expresso em HNSCC.devido à heterogeneidade clínica do cancro da mama, a tecnologia de microarray pode ser o instrumento ideal para estabelecer uma classificação mais precisa. Estudos iniciais utilizando perfis de expressão baseados em microarray demonstraram a sua capacidade de classificar correctamente os cancros da mama negativos para o receptor de estrogénio e positivos para o receptor de estrogénio (Perou et al., 2000; West et al., 2001) e para diferenciar tumores relacionados com BRCA1 de tumores relacionados com BRCA2 e esporádicos (Hedenfalk et al., 2001; van’t Veer et al., 2002).o estudo de van’Veer et al. tem sido um dos estudos mais extensos e informativos realizados até à data. Os autores examinaram 117 amostras primárias da mama por análise de expressão genética baseada em microarray para desenvolver perfis prognósticos e compará-los com marcadores prognósticos conhecidos no câncer de mama. Dos 5.000 genes com perfis de expressão variável, 70 foram identificados para a precisão ideal na previsão da doença recorrente. Usando esta classificação, Os autores previram corretamente o resultado real da doença para 65 dos 78 pacientes. Cinco pacientes com bom prognóstico e oito pacientes com mau prognóstico foram incorretamente atribuídos. Foram utilizados marcadores de prognóstico padrão no cancro da mama para estimar o risco de recorrência do cancro e ajudar a tomar decisões sobre a terapêutica adjuvante. Infelizmente, os marcadores de prognóstico atuais não identificam adequadamente a terapia mais correta para o paciente. O poder preditivo da abordagem microarray é muito maior do que o das abordagens atualmente utilizadas, mas precisa ser validado em estudos clínicos mais prospectivos. Se o valor prognóstico desta abordagem fosse confirmado, o classificador de caracterização da expressão resultaria numa diminuição de cerca de quatro vezes nos doentes a receber terapêutica adjuvante desnecessariamente (Caldas e Aparicio, 2002).Martin et al. (2001) described a method of identifying circulating breast cancer by a two-step process of differential display and high-sensitivity array-based expression profiling. Mesmo que o potencial desta técnica seja promissor, a sua sensibilidade e especificidade ainda precisam de ser melhoradas e é necessário mais trabalho para determinar o significado clínico da detecção de perfis de expressão genética no sangue periférico. Alguns artigos demonstraram agora uma ligação entre perfis de expressão tumoral usando tecnologia de microarray e resultados clínicos. Por exemplo, Sorlie et al. (2001) demonstrated that tumoral subclasses defined by expression profiling can predict disease-free and overall survival, and Sotiriou et al. (2002) mostrou que os perfis de expressão pré-tratamento previam resposta clínica à quimioterapia em uma pequena amostra de tumores mamários. Embora o estudo de Sorlie et al. foi muito provocante, os autores não compararam o valor prognóstico dos grupos identificados por clustering hierárquico com fatores prognósticos atualmente usados no câncer de mama. Uma vez que a resistência às drogas no câncer é um grande obstáculo para o sucesso da quimioterapia, a viabilidade de obter um perfil molecular potencial ou impressão digital de medicamentos anticancerígenos em células cancerosas pela tecnologia microarray é fundamental para prever a resposta da quimioterapia. Kudoh et al. (2000) demonstrated this ability to defining changes in gene expression profiles in a breast cancer cell line treated with quimioterapia. Monitorizaram os perfis de expressão das células do cancro da mama MCF-7 que foram tratadas transitoriamente com doxorrubicina ou seleccionadas para resistência à doxorrubicina. Este estudo demonstrou que o tratamento transitório com doxorrubicina alterou a expressão de um grupo diverso de genes de uma forma dependente do tempo.nos últimos anos, vários investigadores publicaram estudos interessantes sobre o perfil de expressão de cancros ováricos. Martoglio et al. (2000) Analysis the gene expression profiles of five normal ovaries and four poorly differented serous papillary ovary adenocarcinoma samples. Usando uma pequena ‘in-house’ membrana de nylon cDNA microarray, eles encontraram um aumento global na angiogênese relacionados a marcadores (e.g. angiopoietin-1, VEGF), apoptótico e neoplásicas marcadores de resposta imune mediadores e novos potenciais marcadores de câncer de ovário (e.g. cofilin, moesin e neurônio-restritivas silenciador fator de proteína) no câncer de tecido. O estudo foi intrigante porque eles usaram um array cDNA de baixo custo adaptado para estudos de vias específicas, tais como angiogênese e tumorigênese. Uma vez que é problemático acessar uma quantidade adequada de tecido tumoral ovárico precoce, os pesquisadores usaram diferentes estratégias para contornar a necessidade de quantidades de tecido tipicamente necessárias pela análise de microarray. Por exemplo, Ismail et al. (2000) reported a study of 864 DNA elements screened against 10 ovarian cancer cells lines and five normal epitelial cell lines using short-term cell culture to expand the ovarian surface epitelium before RNA extraction. Outros investigadores purificaram o epitélio ovárico através de procedimentos in vitro, tais como a adesão ao vidro ou ao enriquecimento imunomagnético (Ono et al., 2000; Welsh et al., 2001b). No entanto, estas duas abordagens podem introduzir preconceitos na expressão genética observada. De facto, a primeira abordagem (Ismail et al., 2000) utiliza células cancerígenas cultivadas, que podem não reflectir cancros in vivo devido à possibilidade de alterações na expressão genética secundária que ocorram in vitro em resultado de condições de cultura. A segunda estratégia (Ono et al., 2000; Welsh et al., 2001b) é muito longa e pode resultar na degradação de mensageiros RNA menos estáveis. Evitar possíveis preconceitos inerentes às culturas in vitro utilizadas em alguns estudos (Ismail et al., 2000; Matei et al., 2002), outros investigadores têm estudado padrões de expressão genética diretamente a partir de tumores cirurgicamente ressecados (Shridhar et al., 2001). Os microarrays pequenos e especializados têm várias vantagens práticas e podem revelar informações que podem ser perdidas em microarrays maiores. Sawiris et al. (2002) used a highly specialized cDNA microarray named ‘Ovachip’, and found this microarray extremely sensitive at differentiating ovarian cancer from colon cancer based on gene expression patterns. Os biomarcadores de rastreio do cancro do ovário são muito importantes devido à fase tardia do diagnóstico e à fraca sobrevivência associada a este tipo de cancro. Recentemente, dois estudos utilizaram a tecnologia microarray para identificar dois potenciais marcadores séricos de cancro do ovário sobreexpressos, chamados osteopontina e prostasina, e relataram a validação preliminar da sua utilização para a detecção precoce da doença (Mok et al., 2001; Kim et al., 2002).

Microarray e outros cancros

a aplicação da tecnologia de microarray a outros cancros humanos está a expandir-se rapidamente. The pioneering study of Golub et al. (1999) demonstrou a possibilidade de distinguir leucemia mielóide aguda e leucemia linfoblástica aguda (ALL) com base na expressão do gene de monitoramento e de como, em uma simulação de situação ‘cego’ para o diagnóstico histológico, as duas classes poderia ter sido descoberto pelo gene padrões de expressão sozinho. Alizadeh et al. (2000) identified the two forms of difuse large B-cell lymphoma (DLBCL) on the basis of gene expression profiles that are indicative of diffuse stages of B-cell differentiation. Curiosamente, esta classificação molecular tem valor prognóstico independente da estratificação pela classificação clínica usual. Para estudar a expressão genética em neoplasias linfóides, um grande grupo colaborativo criou um microarray especializado, chamado “Linfochip”, que é enriquecido em genes que são selectivamente expressos em linfócitos e em genes que regulam a função linfocitária (Alizadeh et al., 1999). Este grupo usou este microarray para examinar o DLBCL e encontrou duas formas molecularmente diferentes deste tumor. Além disso, demonstraram que os subgrupos da DLBCL definiram um subgrupo de doentes com um prognóstico clínico distinto. To test the hypothesis that B-cell chronic lymphocytic leukemia (LLC) is more than one disease, Rosenwald et al. (2001) related the gene expression patterns of CLL to their Ig mutational status and to other types of normal and malignant B cells. Curiosamente, os genes identificados como altamente expressos em LLC em comparação com DLBCL foram expressos de forma equivalente em todas as amostras de LLC, independentemente do seu estado de mutação Ig. Este estudo sugeriu que todos os casos de LLC compartilhavam um mecanismo comum de transformação e/ou célula de origem. Um estudo recente (Stratowa et al., 2001) propôs uma lista de potenciais novos marcadores de prognóstico envolvidos no tráfico de linfócitos e associados com o estadiamento da doença e/ou a sobrevivência do paciente.num estudo muito recente, Gariboldi et al. (2003) analysis the gene expression profiles in the normal tissue of skin tumoral-susceptible and-resistant mice in order to identify genes that play a functional role in genetic susceptibility. Este estudo sugeriu um papel do gene Scca2, um membro da superfamília dos inibidores da protease da serina, na predisposição genética para tumores da pele.

Microarray technology has also been used in analysing melanoma (Bittner et al., 2000). Este estudo sugeriu que os perfis de expressão genética dentro do tecido de um paciente individual podem ser notavelmente conservados ao longo do tempo e que a análise global da transcrição pode identificar subtipos não reconhecidos de melanoma cutâneo e prever características fenotípicas experimentalmente verificáveis.estudos em células e tecidos cancerígenos do cólon demonstraram supressão significativa do gene cinase, WEE1Hu (Backert et al., 1999).muitos transcriptomas mudam após uma sobre-expressão específica de genes relacionados com o tumor. Por exemplo, temos utilizado um sistema de expressão mediado por adenovírus do gene supressor de tumor RB2/p130 em uma linha celular de câncer de pulmão não-pequeno, a fim de identificar genes específicos que são regulados por pRb2/p130 (Russo et al., 2003). Os nossos resultados de microarray identificaram uma variedade de genes envolvidos em muitos processos celulares, incluindo divisão celular, sinalização celular/comunicação celular, estrutura celular/motilidade e expressão genética e metabolismo. Estes resultados sugerem novos biomarcadores terapêuticos potenciais no carcinoma do pulmão. Além disso, os resultados de outro estudo de microarray cDNA indicam que a sobreexpressão do gene supressor do tumor PTEN pode inibir a invasão do câncer de pulmão através da regulamentação de um painel de genes (Hong et al., 2000). À luz dos dados acima, é claro que a abordagem microarray é muito importante na análise de uma variedade de tipos de tumor.