clorura de litiu ucide în mod eficient parazitul albinelor melifere Varroa destructor printr-un mod sistemic de acțiune

studiu Pilot: de la ARNr la clorură de litiu

într-un studiu pilot, albinele melifere infestate cu acarieni au fost plasate în cuști și hrănite cu sirop de zaharoză care conține Arns de gene Varroa potențial esențiale (tabelul suplimentar S1). Sirop de zaharoză simplu (netratat) și sirop cu dsRNA pe baza secvenței de codificare pentru proteina fluorescentă verde GFP (dsGFP ctrl) au servit ca controale. GFP este exprimat în meduza hidrozoană bioluminescentă Aequorea victoria. Secvența GFP a fost aleasă ca control, deoarece nu există o genă omoloagă în genomul albinelor sau al acarianului Varroa. În grupul netratat, mortalitatea acarienilor a fost <5%. În schimb, toți acarienii de pe albine care au primit soluție de zaharoză care conține dsRNA care vizează genele Varroa au fost efectiv uciși în decurs de trei zile. Cu toate acestea, un efect identic asupra acarienilor a fost observat într-un experiment de control în care albinele au fost hrănite cu GFP dsRNA (Fig suplimentar. S1). Aceste rezultate au exclus mecanismul mediat de Arnai propus, dar au sugerat fie un efect încă necunoscut al ARN, fie activitatea altor componente din soluția de testare. Deoarece concentrații mari de clorură de litiu (LiCl) au fost utilizate în producția de dsrna și, prin urmare, hrănite albinelor împreună cu dsRNA, am ales să hrănim LiCl în soluție de zaharoză albinelor în cuști pentru a-i testa activitatea împotriva acarienilor Varroa. În mod izbitor, LiCl la concentrații de 25 mM, care corespunde concentrației calculate în soluția dsRNA, a ucis acarienii la fel de eficient ca substanțele testate care conțin dsRNA. Mai mult, după ce LiCl a fost îndepărtat în mare parte din dsRNA prin spălare extinsă (dsgfp spălat ctrl), activitatea miticidă a fost substanțial diminuată, așa cum este indicat prin debutul întârziat și activitatea redusă (Fig suplimentar. S1). Din aceste date, am ajuns la concluzia că LiCl, nu ARN knockdown, a mediat activitatea observată pe acarienii Varroa și că ar merita să se analizeze potențialul LiCl ca varroacid.

concentrația efectivă a clorurii de litiu

pentru a corobora observațiile primare ale studiului nostru pilot, am stabilit experimente cu cage cu diferite concentrații de LiCl pentru o analiză statistică robustă. În plus față de concentrația de 25 mM, care s-a dovedit a fi eficientă în studiul pilot, am utilizat concentrații de 2 mM, 4 mM și 10 mM pentru a determina pragul inferior de eficacitate. Rezultatele au susținut rezultatele studiului anterior și au demonstrat efecte miticide semnificative pentru concentrațiile de LiCl de până la 2 mM la care a fost prezentată o creștere substanțială a mortalității acarienilor (P < 0,001, test log-rank; tabelul suplimentar S2). Concentrațiile mai mari de 10 mm și 25 mM au sporit semnificativ mortalitatea acarienilor începând cu a doua zi de tratament și au obținut exterminarea a peste 96% din acarienii tratați la sfârșitul experimentului (Fig. 1a, tabelul suplimentar S2). În experimentele de control fără LiCl în soluția de hrănire, mortalitatea acarienilor a atins în medie 9,3% și, prin urmare, s-a încadrat bine în intervalul ratelor de mortalitate obținute pentru acarienii ținuți pe albinele cuști netratate în condiții de mediu diferite33. Pe baza acestor rezultate, am confirmat un efect clar al LiCl asupra viabilității acarienilor într-un interval de concentrație cuprins între 2 mM și 25 mM.

mortalitatea acarienii Varroa și albinele de miere după hrănirea clorurii de litiu (LiCl) albinelor în cușcă. (a) curba de supraviețuire Kaplan-Meier a femelelor de acarieni Varroa ținute pe albine în cuști hrănite cu LiCl în concentrații cuprinse între 2 mm–25 mM [N = 33, 9, 9, 12 și 9 cuști pentru 0 mM (martor), 2 mM, 4 mM, 10 mM și, respectiv, 25 mM]. La toate concentrațiile, supraviețuirea acarienilor în grupurile de tratament a fost semnificativ diferită de martor (P < 0,001, test log-rank cu corecție Bonferroni). (b) curba de supraviețuire Kaplan-Meier a albinelor lucrătoare în cuști și a acarienilor Varroa femele după expunerea la LiCl 24 h (N = 9 cuști). Supraviețuirea acarienilor în grupul de tratament a fost semnificativ diferită de grupul de control (P < 0,001, testul log-rank), dar nu au existat diferențe semnificative de grup în mortalitatea albinelor.

în aceste experimente, albinele în cușcă au fost hrănite cu concentrația respectivă de LiCl pe parcursul mai multor zile până când toți acarienii au fost uciși de tratament. Cu toate acestea, pentru utilizarea potențială în practica apicolă, ar fi de preferat o perioadă de tratament mai scurtă și definită. Prin urmare, am efectuat un experiment suplimentar, în care concentrația cea mai eficientă de 25 mm LiCl (Fig. 1a) a fost administrat timp de 24 de ore, urmată de hrănirea cu soluție de zahăr timp de încă șase zile. La sfârșitul perioadei de observație, 92.9% dintre acarieni (n = 225 acarieni, P < 0,001, test log-rank) au fost uciși fără niciun efect semnificativ asupra albinelor tratate (vezi paragraful următor). Acest rezultat demonstrează clar că chiar și o hrănire pe termen scurt de 25 mm LiCl este suficientă pentru a diminua substanțial populația de acarieni.

pentru a determina cu precizie cantitatea ingerată de LiCl de către albine care este necesară pentru a ucide acarienii parazitici, 12 albine nou eclozate au fost hrănite artificial cu 10 ilecl de soluții LiCl de 4 mM până la 100 mM și ținute individual cu un acarian phoretic timp de cinci zile în cuști. În cazul soluțiilor de 4 mM și 10 mM, care corespundeau unei absorbții de 1,7 și, respectiv, 4,2 hectolitri de LiCl, efectul nu a fost semnificativ diferit de cel al martor netratat (n = 12 acarieni, P = 1.000, test log-rank, tabelul suplimentar S3). Cu toate acestea, o singură doză de 25 mM, corespunzând la 10,6 unqq de LiCl consumată de albină a fost suficientă pentru a ucide 100% din acarienii phoretici în decurs de 48 de ore (Fig. 2).

mortalitatea acarienilor phoretic Varroa ținuți la albinele care au fost hrănite individual cu 10 ilct dintr-o soluție de clorură de litiu la concentrații cuprinse între 4 mM și 100 mm albinele au fost hrănite licl o singură dată la începutul experimentului, apoi au primit sirop de zaharoză pe parcursul a cinci zile. Pentru fiecare concentrație au fost analizate 12 cuști cu câte o albină și câte un acarian Varroa. Supraviețuirea acarienilor a fost semnificativ redusă comparativ cu grupul de control atunci când concentrațiile de 25 mM și mai mari au fost hrănite albinelor (p < 0,001, test log-rank).

efectul asupra albinelor lucrătoare

pentru analiza tolerabilității LiCl la albinele lucrătoare, cuștile de testare care au fost utilizate pentru a analiza mortalitatea acarienilor (Fig. 1a) au fost înregistrate suplimentar pentru mortalitatea albinelor lucrătoare. După expunerea la 2 mM, 10 mM și 25 mm LiCl care s-au dovedit a exercita activitate miticidă, mortalitatea albinelor lucrătoare tratate a variat în medie de la 3 la 7% în cadrul diferitelor grupuri de hrănire. Cu excepția lotului LiCl de 10 mM (N = 12 cuști, P = 0,015, test log-rank; tabelul suplimentar S4), valorile nu au fost semnificativ diferite de mortalitatea de 4% din lotul martor netratat. În plus, ratele de mortalitate ale grupurilor noastre de control s-au încadrat în intervalul de mortalitate al albinelor de colivie netratate, necesar pentru controlul testelor toxicologice34, confirmând astfel validitatea sistemului nostru de testare. De asemenea, tratamentul de 24 de ore cu LiCl nu a afectat mortalitatea albinelor lucrătoare (Fig. 1B; n = 9 cuști, P = 0,308, test log-rank). O bună tolerabilitate a LiCl la albine a fost confirmată și prin hrănirea unei singure doze (pentru mortalitatea acarienilor vezi Fig. 2) care nu a determinat o creștere semnificativă a mortalității albinelor lucrătoare (P = 1.000, test log-rank; tabelul suplimentar S5).apoi, diferite concentrații de LiCl au fost hrănite continuu până când ultima albină în cușcă a murit pentru a investiga răspunsul la expunerea pe termen lung. Aici, tratamentul a redus semnificativ durata medie de viață a albinelor lucrătoare proaspăt eclozate de la 26 de zile în cuștile de control netratate la 23 și 22 de zile pentru 2 mM și, respectiv, 10 mm LiCl (n = 60 albine, P = 0,024, test log-rank; tabelul suplimentar S6). La albinele care au primit cea mai mare concentrație de 25 mm LiCl, durata de viață a fost redusă semnificativ la 19 zile în medie (Fig. 3a).

mortalitatea albinelor după hrănirea albinelor în cuști cu clorură de litiu. (a) curba de supraviețuire Kaplan-Meier a albinelor lucrătoare în cuști în timpul expunerii cronice la LiCl. Dietele LiCl la concentrații de 2 mM, 10 mM și 25 mM au fost hrănite ad libitum până la moartea ultimei albine (n = 6 cuști cu câte 10 albine fiecare). Supraviețuirea tuturor grupurilor tratate a fost semnificativ diferită de controlul siropului de zahăr (P < 0,01, test log-rank cu corecție Bonferroni). (b) curba de supraviețuire Kaplan-Meier a albinelor lucrătoare în cuști după o expunere de 24 de ore la LiCl. Dietele LiCl la concentrații de 2 mM, 10 mM și 25 mM au fost hrănite ad libitum în primele 24 de ore după eclozare și apoi înlocuite cu sirop de zaharoză (n = 12 cuști cu câte 10 albine fiecare). Supraviețuirea tuturor grupurilor tratate nu a fost semnificativ diferită de controlul siropului de zahăr (P > 0, 1, test log-rank cu corecție Bonferroni).

cu toate acestea, LiCl pare să împiedice viabilitatea albinelor numai dacă este administrat pe o perioadă lungă de timp, așa cum este indicat într-un experiment suplimentar în care LiCl a fost hrănit în primele 24 de ore după eclozare și apoi a fost înlocuit cu sirop de zaharoză până când ultima albină în cușcă a murit (Fig. 3b). Aici, durata medie de viață a albinelor lucrătoare proaspăt eclozate a variat de la 22 de zile (10 mM) la 24 de zile (martor) fără diferențe semnificative între tratamente (N = 120 albine pe tratament, p 0,126, test log-rank; tabelul suplimentar S7). Pe baza acestor date provenite de la albinele în cușcă, concluzionăm că chiar și un tratament LiCl pe termen scurt este suficient pentru a eradica complet infestarea cu acarieni Varroa, cu un impact redus sau deloc asupra viabilității albinelor lucrătoare. Aceste rezultate obținute în testele cuști în condiții controlate reprezintă un prim pas de succes și promițător către o nouă abordare a tratamentului cu Varroa. Cu toate acestea, eficiența și efectele secundare trebuie confirmate în condiții de teren.

teste de teren cu clorură de litiu în roiuri artificiale

pentru a aproxima condițiile de teren, am testat LiCl de 25 mm și 50 mM în nouă roiuri artificiale fără puiet constând dintr-o regină și aproximativ 20.000 de albine fiecare. Aceste concentrații au fost alese pe baza experimentelor anterioare cu albine în cuști, utilizând cea mai mare doză care a fost încă tolerată de albine în timpi scurți de aplicare (25 mM). Deoarece o distribuție uniformă a siropului de zaharoză pe întregul roi artificial de aproximativ 20.000 de albine ar fi putut fi dificil de realizat, am testat suplimentar o concentrație de LiCl de 50 mM pentru a ne asigura că fiecare albină a fost expusă la cantități suficiente de litiu. În consecință, roiurile au fost hrănite ad libitum cu sirop de zaharoză care conține 25 mm LiCl (n = 6) sau 50 mM (N = 3) pentru o perioadă de trei zile, urmată de o aplicare topică a perizin xvide. Perizin xixt care conține organofosfatul coumaphos ca ingredient activ, este un varroacid foarte eficient, care este utilizat în mod obișnuit ca tratament de control35. Mortalitatea acarienilor a fost monitorizată pe o perioadă de cinci zile. Înainte de tratamentul de control, LiCl de 25 mM a ucis aproximativ 90% din acarienii prezenți în roiurile artificiale (Tabelul 1). Soluția concentrată mai mare (50 mM), cu toate acestea, nu a crescut acest efect (testul inqut2, P = 0,953). În total, eficacitatea a fost oarecum mai mică în comparație cu testele cuști. O explicație ar putea fi că distribuția LiCl într-un grup de mii de albine necesită mai mult timp până când ultima albină individuală consumă o doză suficientă pentru a ucide acarianul parazitar respectiv. Timpul necesar de hrănire a unor astfel de entități uriașe de 20.000 de albine și mai mult trebuie analizat în experimente ulterioare.

eficacitatea altor compuși ai litiului și a sărurilor non-litiu

pentru a confirma că litiul este componenta activă pentru efectul asupra acarienilor Varroa am testat o serie de compuși ai litiului și am comparat efectele miticide cu sărurile non-litiu. Un interes deosebit au fost citratul de litiu, un compus cu trei ioni de litiu, sulfat de litiu și carbonat de litiu, care au doi ioni de litiu în comparație cu un singur ion de litiu din LiCl. Au fost incluși compuși suplimentari cu un singur ion de litiu (lactat de litiu, acetat de litiu), dar solubilitate diferită, reactivitate chimică și preț pentru a analiza eficacitatea și tolerabilitatea în comparație cu LiCl. În experimentele cu cușcă, toți compușii au eliminat 100% din acarieni la 25 mM în decurs de trei (citrat de litiu și acetat de litiu) până la patru zile (sulfat de litiu, lactat de litiu și carbonat de litiu). De asemenea, soluțiile de testare de 4 mM au ucis în întregime acarienii phoretici în decurs de cinci (citrat de litiu, sulfat de litiu și acetat de litiu) până la șapte zile (lactat de litiu), cu excepția carbonatului de litiu (Tabelul 2; Tabelul suplimentar S8).

mortalitatea albinelor lucrătoare nu a fost semnificativ crescută la niciuna dintre concentrații comparativ cu albinele martor netratate, cu excepția sulfatului de litiu de 25 mM și a lactatului de litiu de 25 mM (tabelul suplimentar S9). Cu aceste experimente am putea confirma că alți compuși ai litiului au un potențial similar pentru utilizarea ca acaricid sistemic. Acest lucru ar putea crește flexibilitatea pentru posibila proiectare a unui produs veterinar. Având în vedere prețul, clorura de litiu și citratul de litiu sunt cei mai ieftini compuși. Sulfatul de litiu este mai puțin adecvat datorită tolerabilității mai mici a albinelor și carbonatului de litiu datorită unei solubilități relativ scăzute în apă.

pentru a investiga mai detaliat eficacitatea dependentă de concentrație a compușilor de litiu, am comparat LiCl cu citratul de litiu (Li3C6H5O7), care a avut cea mai mare diferență în numărul de ioni de litiu pe moleculă, la cinci concentrații diferite într-un interval de 1 mM–25 mM. Toate concentrațiile de citrat de litiu au prezentat o activitate acaricidă semnificativ mai mare comparativ cu LiCl, dar nu a existat nicio diferență în mortalitatea albinelor (Tabelul 3, tabelele suplimentare S9 și S11). Prin urmare, citratul de litiu ar putea reprezenta un ingredient activ și mai bun.

ca un control fără litiu și pentru a exclude clorura ca agent activ am testat, de asemenea, sărurile alcaline clorură de sodiu (NaCl) și clorură de potasiu (KCl) și, de asemenea, clorură de magneziu (MgCl) la 25 mM. nu am observat un efect varroacid pentru NaCl sau KCl (n = 3 cuști, P = 1.000, test log-rank, test suplimentar tabelul S12). În testele cu MgCl 100% din albinele în cușcă au murit în decurs de cinci zile (P < 0.001, testul log-rank) și, în funcție de numărul în scădere al albinelor, experimentul a fost încheiat înainte ca efectul asupra acarienilor să poată fi analizat. Pe baza acestor experimente, am ajuns la concluzia că litiul mediază într-adevăr activitatea acaricidă într-o manieră dependentă de doză și că citratul de litiu prezintă cele mai favorabile proprietăți ale tuturor compușilor testați până în prezent.

potențialul compușilor de litiu ca varroacid nou

am arătat că nu ARN-urile dublu catenare ipotezate inițial împotriva genelor esențiale Varroa, ci surprinzător sărurile de litiu mediază un puternic efect acaricid asupra acarienilor Varroa asupra albinelor în cuști și în roiurile artificiale. Astfel, aceste rezultate arată că compușii de litiu reprezintă o nouă clasă de agenți acaricizi cu un potențial remarcabil și o tolerabilitate remarcabil de bună de către albine. Sensibilitatea diferită a acarienilor și albinelor la LiCl este și mai remarcabilă, având în vedere că, datorită efectelor de diluare, concentrația de LiCl în hemolimfa albinelor va fi probabil substanțial mai mică decât concentrația alimentată albinelor.

important, constatările noastre nu implică faptul că efectele acaricide ale abordărilor bazate pe RNAi publicate de Garbian și colab.32 sunt în general mediate de LiCl. După hrănirea unui amestec de dsRNA la albinele de miere pe o perioadă de 60 de zile, Garbian și colab.32 a înregistrat o creștere lentă a mortalității acarienilor, cu o eficacitate finală a tratamentului de numai 60%. Având în vedere răspunsul rapid și extrem de eficient al roiurilor noastre artificiale la tratamentele cu LiCl, sunt posibile diferite moduri de acțiune: în timp ce efectele mediate de RNAi par să exercite efecte pe termen lung, compușii de litiu reprezintă un mecanism independent cu debut rapid și eficacitate ridicată.

ca varroacid, LiCl afișează unele caracteristici care sunt unice în această combinație: (i) LiCl acționează sistemic prin hrănirea albinelor („ușor de aplicat”), (ii) este solubil în apă și,prin urmare, nu se va acumula în ceara de albine, ceea ce reprezintă o problemă crucială pentru conceptele de tratament pe termen lung care utilizează varroacide sintetice cu proprietăți lipofile36, 37 (iii) toxicitatea orală a majorității compușilor de litiu la mamifere este relativ scăzută38 (iv) nu are efect respingător asupra soluției de hrănire în intervalul de concentrație relevant de 2-25 mM39 și (v) este disponibil la prețuri moderate. Foarte promițător este faptul că o singură aplicare de numai 10 ilql de LiCl într-o soluție de 25 mM (corespunzând unei doze de 10,6 ilql) per albină individuală este suficientă pentru a ucide acarienii phoretici. O provocare pentru cercetări ulterioare va fi dezvoltarea unei tehnici inteligente de aplicare pentru roiuri și colonii de dimensiuni mari, pentru a se asigura că toate albinele primesc cantitatea critică de compus activ.

în prezent, nu știm cum ucide LiCl acarienii Varroa phoretici și există puține publicații despre efectul LiCl în insecte40. În medicina umană, litiul a fost utilizat încă din anii 1870 și este un agent de stabilizare a dispoziției indicat pentru tratamentul episoadelor maniacale și ca tratament de întreținere pentru tulburarea bipolară41. Având în vedere utilizarea lor terapeutică, compușii de litiu și profilul lor de toxicitate au fost investigați cu atenție. Până în prezent, o serie de enzime care acționează asupra metabolismului, dezvoltării,hematopoiezei și a altor procese au fost propuse ca ținte potențiale42, 43. Aceste enzime necesită ioni metalici, iar litiul își exercită activitatea într-o manieră necompetitivă, care apare cel mai probabil prin deplasarea unui cation bivalent. Desigur, în prezent nu avem niciun indiciu că efectul miticid observat al compușilor de litiu se bazează pe un mod de acțiune comparabil.

suntem conștienți și de faptul că rezultatele noastre reprezintă doar primul pas spre dezvoltarea unui nou produs veterinar. Testele pe teren în coloniile care zboară liber sunt la fel de necesare ca analiza efectelor secundare subletale și pe termen lung asupra albinelor adulte și a puietului de albine și a posibilelor probleme de reziduuri din miere.

cu toate acestea, rezultatele prezentate aici indică deja că LiCl are potențial ca tratament eficient și ușor de aplicat pentru roiurile artificiale și naturale și în special pentru numărul mare de albine ambalate utilizate pentru polenizare în Statele Unite11,44. În plus, elucidarea mecanismului de acțiune ar putea deschide noi căi pentru dezvoltarea specifică a produselor veterinare pentru combaterea acarienilor Varroa.