enciclopedia proiectului embrion

Din 1958 până în 1961, Leonard Hayflick și Paul Moorhead din SUAa dezvoltat o modalitate în laborator de a cultiva tulpini de celule umanecu seturi complete de cromozomi. Anterior, oamenii de știință nu au pututsustain culturile celulare cu celule care aveau două seturi complete de cromozomi, cum ar fi celulele umane normale (diploide). Drept urmare, oamenii de știință s-au străduit să studieze biologia celulară umană, deoarece nu exista o sursă fiabilă de celule care să reprezinte celule umane diploide. În experimentele lor, Hayflick și Moorhead au creat tulpini durabile de celule umane care au păstrat ambele seturi complete de cromozomi. Apoi au înghețat eșantioane din culturi, astfel încât celulele să rămână viabile pentru futureresearch. Ei au remarcat, de asemenea, că celulele ar putea diviza doar un anumitde câte ori înainte de a se degrada și a muri, fenomen numit ulterior limita Hayflick. Experimentul lui Hayflick și Moorhead a permiscercetarea biologiei dezvoltării și a vaccinurilor care se bazau pe tulpinile humancell. Hayflick s-a specializat în cultivarea celulelor în medii controlate. În 1958,s-a alăturat Institutului Wistar din Philadelphia, Pennsylvania, o instituție de cercetare care a studiat biologia celulară și virușii, la invitația noului director al Institutului, HilaryKoprowski. Koprowski ia însărcinat pe Hayflick să creeze culturi celulare pentruutilizarea în experimentele altor cercetători de la institut. Hayflicklater și-a amintit totuși că și-a folosit misiunea de cercetare ca o oportunitate de a studia metodele și limitările culturilor celulare. Pentru a asista la cultivarea celulelor, Hayflick și-a recrutat colegul Wistar,Paul Moorhead, care a studiat structura și funcția celulelor și a cromozomilor.

lipsa longevității culturilor normale de celule umane în laborator a limitat cercetările pe care oamenii de știință le-ar putea face. Cu cellcultures, oamenii de știință cresc populații de celule în condiții incontrolate de sticlă pentru utilizare în cercetare. Cercetătorii cresc de obicei culturi de celule în vase de sticlă sau petri care conțin mediu de creștere,o soluție care conține săruri dizolvate, zaharuri și alți nutrienți celulari. De-a lungul primei jumătăți a secolului al XX-lea,cercetătorii au emis ipoteza că toate culturile celulare normale și sănătoase au avut o capacitate înnăscută de a se diviza la nesfârșit pe baza constatărilor anterioare publicate de biologul Alexis Carrel în 1912 în SUA. În practică,însă, cercetătorii nu au observat o diviziune nesfârșită în celulele normale.În schimb, celulele din cultură s-au degradat în cele din urmă și au murit. Oamenii de știință au susținut că celulele s-au degradat pentru că au epuizat mediul de creștere a culturii tuturor nutrienților săi sau pentru că tehnicienii laboratorului nu au reușit să mențină condițiile ideale de mediu pentru creșterea celulară. Singurele celule umane care s-au divizat continuu în cadrul laboratorului, numite linii celulare nemuritoare, au fost celule derivate din celulele canceroase. Aceste linii celulare reprezentau doar câteva aspecte ale biologiei celulare umane.

la mijlocul secolului al XX-lea, cercetătorii medicali nu au putut explica ce a cauzat cancerul și mulți oameni de știință, inclusiv Hayflick și Moorhead,au emis ipoteza că anumite virusuri ar putea provoca creșteri canceroase. Deși mulți microbiologi au folositcelule derivate din liniile celulare canceroase în cercetarea medicală, celulele nu au fost în general utilizate în dezvoltarea vaccinurilor, deoarece oamenii de știință s-au îngrijorat că vaccinurile vor fi contaminate cu virusurile cauzatoare de cancer, eventual conținute în celulele în sine. Mai mult, celulele din liniile canceroase, datorită diviziunii lor constante, erau heteroploide, ceea ce înseamnă că aveau fie un număr mai mare, fie un număr mai mic de cromozomi decât celulele umane normale, care au două seturi complete de cromozomi. Celulele heteroploide au rezultat adesea dindiviziunea celulară continuă pe mai multe generații de celule din cultură. Hayflick și Moorehead au produs celule umane care ar putea fi cultivate de-a lungul mai multor generații, cum ar fi celulele din celulele canceroase, dar au păstrat, de asemenea, numărul diploid de cromozomi al celulelor și au redus riscul de la virusurile teoretice cauzatoare de cancer. Ei și-au descris experimentul în „cultivarea în serie a tulpinilor diploide umane”, publicat în 1961. Hayflick și Moorhead au căutat să dezvolte tulpini de celule umane care ar putea fi cultivate pentru perioade lungi de timp în laborator, dar totuși și-au păstrat numărul diploid de cromozomi. Ei au emis ipoteza că, dacă ar fi fosttransplantate probe mici de celule umane diploide din culturi deja în creștere într-un nou mediu de creștere, ar crește foarte mult numărul de celule diploide din cultură. Hayflick și Moorhead au propus că înghețarea unor cantități mici de celule diploide ar întrerupe creșterea și diviziunea celulozei fără a ucide celulele. Celulele congelate ar putea fi apoi stocate până când cercetătorii le-au cerut, moment în care ar putea bloca celulele înghețate, restabilindu-le la activitatea celulară normală.Hayflick și Moorhead au prezis că, după decongelare, acele celule cultivate nu vor deveni heteroploide ca celulele din alte linii și își vor păstra setul diploid de cromozomi. experimentul lui Hayflick și Moorhead a avut ca scop atât crearea unei metode de creștere a celulelor diploide umane în laborator pentru utilizarea pe termen lung a cercetării, cât și determinarea faptului dacă aceste tulpini celulare au contribuit sau nu la creșterea cancerului.Hayflick și Moorhead au crescut mai întâi celule umane în culturi de creștere în laborator, au transplantat mici probe de celule în recipiente noi pentru a crește culturi celulare suplimentare și au înghețat probe de celule din aceste culturi pentru a păstra celulele pentru cercetări ulterioare. Apoi, pentru a testa dacă celulele înghețate erau încă viabile pentru cercetare, Hayflick și Moorhead au rănit celulele înghețate și au încercat să crească culturi celulare din ele.În cele din urmă, au implantat probe din acele tulpini de celule diploide umane în țesuturi vii pentru a vedea dacă au dus la creșteri canceroase.

pentru a dezvolta tulpini de celule umane diploide, Hayflick și Moorhead au început să cultive celule din 25 de țesuturi diferite preluate de la fetușii Avortați. Aceste celule au devenit 25 de tulpini diferite de celule umane, numite numeric WI-1 prin WI-25. WI a reprezentat Institutul Wistar, unde au fost dezvoltate celuleletrenele. Hayflick și Moorhead au folosit țesuturi fetaledeoarece, mai mult decât celulele adulte, celulele fetale s-au dezvoltat mai ușor în celulele fibroblaste, care sunt celule specializate care oferă suport structural majorității țesuturilor corpului. Celulele fibroblaste au fost preferabile pentru cultivarea celulelor de laborator, deoarece au crescut rapid și continuu în culturile celulare, oferind o abundență de celule pentru cercetare. Hayflick și Moorhead au tăiat fiecare dintre probele de țesut înmici, subțiri și apoi le-au implantat pe peretele interior al sticlelor de sticlă umplute cu mediu de creștere bogat în nutrienți. Hayflick și Moorhead au plasat apoi sticlele acoperite cu țesut din fiecare tulpină de celule într-un mediu cald timp de trei zile, înlocuind în mod regulat mediul de creștere cu o aprovizionare proaspătă, pentru a începe cultivarea culturii celulare.

Hayflick andMoorhead au lăsat culturile să crească până când celulele au acoperit întreaga sticlă. Fiecare eșantion de celule fetale a fost apoi subdivizat printr-un procesnumită subcultivare. În timpul subcultivării, Hayflick și Moorhead au îndepărtat un mic eșantion de celule și au implantat acele celule pe peretele unei noi sticle de sticlă umplute cu mediu de creștere, creând o nouă cultură de celule din aceeași tulpină celulară. Fiecare nouă cultură celulară a instituit o nouă generație de celule care ar putea fi ea însăși submultivată prin aceeași metodă, permițând numărul total de celulesă crească exponențial. Hayflick și Moorhead au împărțit apoi probele celulelor rămase în porții mici și le-au înghețat pentru a întrerupe creșterea celulelor și a opri orice diviziune celulară ulterioară.

Hayflick și Moorhead au continuat subcultivarea celulelor de două ori pe săptămână timp de aproximativ zece luni, moment în care culturile celulare au încetat să crească și au început să se degradeze.Hayflick și Moorhead au emis ipoteza că celulele au încetat să se împartă din cauza acumulării de produse toxice de creștere celulară în mediul de creștere. Hayflick și Moorhead au încercat să introducă un mediu de creștere proaspăt, fără toxine posibile, dar culturile celulare au continuat să se degradeze și să moară în următoarele câteva luni. Cu toate acestea, alte culturi celulare plasate în același mediu de creștere nu s-au degradat și au murit. Cercetătorii au ajuns la concluzia că ceva despre celuleei înșiși, nu mediul lor, i-au determinat să înceapă să se deterioreze.Hayflick și Moorhead au încercat apoi să determine dacă celulele pe care le-au înghețat ar putea fi folosite pentru a crește mai multe culturi celulare. După dezghețarea probelor mici de celule, Hayflick și Moorheadimplantate celulele pe pereții sticlelor de sticlă. Le-au cultivat din nou în medii de creștere și au descoperit că, chiar și după îngheț, celulele au crescut încă în culturi noi, care ar putea fi ele însele subcultivate. Indiferent de înghețarea sau subcultivările anterioare, cercetătorii ar putea folosi probe din culturi de celule umane diploide pentru a crește culturi de celule umane diploide. Hayflick și Moorhead au creat tulpini de celule umane adiploide care ar putea fi cultivate în culturi de laborator la nesfârșit. Hayflick și Moorhead au investigat apoi dacă celulele cultivate în noile culturi erau diploide. Când au scris despre experiment, au spus că sunt îngrijorați de faptul că este posibil ca celulele să nu fi rămas diploide, deoarece le-au crescut de-a lungul multor generații, ceea ce poate duce la heteroploidie. Folosind microscoape ușoare, Hayflick și Moorhead au analizat mostre de celule în timpul metafazei diviziunii celulare, când cromozomii sunt distincți și ușor de văzut. Ei au numărat numărul de cromozomi în 250celule individuale pentru a obține o estimare a numărului de celule care aveau încă un număr adiploid de cromozomi. Hayflick și Moorhead au stabilit acest lucrumai mult de 97% din celule au fost diploide chiar și după mai mult de douăzeci de generații de subcultivare. Hayflick și Moorhead au concluzionat că procesul lor de cultivare în serie și înghețarea celulelor fetale a fost o metodă eficientă pentru conservarea unei tulpini de celule umane diploide.

în cele din urmă,Hayflick și Moorhead trebuiau să arate că tulpinile lor celulare nu cauzau cancer. Problema cu liniile celulare nemuritoare create de celulele canceroase a fost că cercetătorii au emis ipoteza că celulele ar putea conține viruși cauzatori de cancer. Pentru a se asigura că tulpinile lor newcell nu au provocat cancer, Hayflick și Moorhead au testat tulpina celulară Wi-25 în țesutul viu. Au selectat tulpina WI-25, deoarece a suferit cele mai multe subdiviziuni și a fost cea mai probabilă tulpină de celule care a provocat cancer. Prin urmare, dacă nu, era probabilcă nici una dintre celelalte tulpini nu ar fi.

cercetătorii au implantat celule din tulpina celulară WI-25 în pungile obrazului a cinci hamsteri vii. Ca grup de control experimental, au implantat, de asemenea, cinci pungi de obraz ale altor hamsteri cu celule derivate din celule canceroase. La început, au apărut noduli, un semn precoce al dezvoltării canceruluiîn pungile de control ale ambelor seturi de hamsteri. Cu toate acestea, după trei săptămâni, aproape toți nodulii din hamsterii implantați cu celulele WI-25 au dispărut, în timp ce nodulii din hamsterii implantați cu celule din liniile celulelor canceroase au crescut în dimensiune. Hayflickand Moorhead a efectuat biopsii ale nodulilor rămași pentru a confirmapredicția lor că celulele lor subcultivate nu au provocat cancer.Biopsiile au arătat că nodulii din hamsteri implantați cu celule din liniile celulare canceroase au fost într-adevăr canceroși, în timp ce celulele WI-25 s-au datorat inflamației și sângerării la locul implantării. Hayflick și Moorhead au implantat, de asemenea, o celulă umană similară, WI-1, în țesuturile musculare a cinci pacienți cu cancer pe moarte.De asemenea, el a implantat celule din liniile celulare canceroase în alți cinci pacienți cu cancer terminal. Ca și în hamsteri, la început nodulii au crescutla locurile de implantare ale ambelor grupuri. După câteva zile, nodulii celulari Wi-1 au început să se retragă, în timp ce nodulii s-au înmulțit pacienții internați implantați cu celule din liniile celulare canceroase. La sfârșitul unei săptămâni, aproape toți nodulii WI-1 dispăruseră, iar Hayflick și Moorhead au biopsiat nodulii rămași în ambele grupuri. Rezultatele biopsiilor au arătat că nodulii celulelor canceroase erau heteroploizi, în timp ce nodulii WI-1 erau diploizi și necanceroși. Descoperirile lui Hayflick și Moorhead, pe care le-au publicat în 1961,au demonstrat că celulele diploide umane ar putea fi propagate de-a lungul multor generații, cum ar fi liniile celulare canceroase, fără a deveni heteroploide sau canceroase.

rezultatele au avut un impact imediat și de durată asupra înțelegerii biologiei dezvoltării și a cercetării științifice. Rezultatele experimentului lor au confirmat ipoteza lui Carrel din 1912 că celulele normale au crescut la nesfârșit în cultură, în ciuda observațiilor culturilor celulare degradante în timp. Carrel a sugerat că, prin urmare, celulele, în practică, păreau să se deterioreze și orele suplimentare de vârstă s-au datorat condițiilor imperfecte de creștere de laborator pentru celule.Carrel a susținut că, în condiții ideale, celulele din culturi ar puteaîmpărțiți pe termen nelimitat, acționând efectiv ca o linie celulară nemuritoare.Cu toate acestea, descoperirile lui Hayflick și Moorhead au indicat că organismele îmbătrânite se întâmplă la nivel celular, un proces numit senescență și că celulele ar putea suferi doar un număr limitat de diviziuni înainte de a se degrada și a muri. În timpul experimentului lor, Hayflick și Moorheadau încercat să cultive continuu celulele fetale, înlocuind vechiul mediu de creștere cu mediu proaspăt, bogat în nutrienți. Cu toate acestea, au descoperit astadupă aproximativ patruzeci sau șaizeci de generații, celulele au început să moară mai degrabădecât să se reproducă, fenomen numit ulterior limita Hayflick. Acest rezultat a demonstrat că celulele nu pot crește la nesfârșit în cultură, chiar și în condiții ideale.

metoda lui Hayflick și Moorhead de cultivare în serie a celulelor diploide umane a ajutat, de asemenea, oamenii de știință să mențină o cantitate abundentă de celule umane diploide pentru cercetare. Prin calculele lui Hayflick și Moorhead, o singură tulpină de celule umane ar putea fi subcultivată de suficiente ori pentru a produce aproape 20 de tone metrice de celule viabile. Deși nu este nemuritor din punct de vedere tehnic, această aprovizionare ar fi aproape inepuizabilă în scopuri practice de cercetare. mai mult, crearea de celule umane diploide viabile a permis cercetarea vaccinului.Deoarece Hayflick și Moorhead au arătat că tulpinile lor de celule umane nu au provocat cancer la hamsteri sau oameni, aceste tulpini ar putea fi utilizate invaccine fără amenințarea contaminării vaccinului cu un agent cauzator de cancer. Următoarele tulpini de celule umane derivate în mod similar,cum ar fi WI-38, au devenit baza vaccinurilor pentru bolile copilărieicum ar fi rubeola și varicela. în timp ce mulți cercetători au salutat dezvoltarea tulpinilor de celule umane de către Hayflick și Moorhead, unii,inclusiv Biserica Catolică, au dezaprobat utilizarea materialului fetal avortat în dezvoltarea vaccinurilor pe motive religioase. Ulterior, Vaticanul a declarat că s-au opus metodei de dezvoltare a vaccinurilor derivate din țesuturile fetale, nu utilizării individuale a acestor vaccinuri pentru prevenirea bolilor.

Hayflick și Moorhead au demonstrat nu numai că celulele umane ar putea fi cultivate cu succes în laborator,menținând în același timp un număr diploid de cromozomi, dar și că ar putea menține celulele aproape nedefinitprin subcultivarea serială. Mai mult, experimentul lor a pus bazele pentru ca Hayflick să cerceteze în continuare limita diviziunii celulare în cultură, numită ulterior limita Hayflick. Descoperirile lui Hayflick și Moorhead au permis experimente suplimentare în dezvoltarea biologiei și a vaccinului prin furnizarea de celule umane abundente pentru cercetare.