Monitorizarea precoce a tratamentului tuberculozei de către Xpert MTB/RIF

către editori:

progresele înregistrate în îmbunătățirea capacității de laborator pentru diagnosticul tuberculozei (TB) au condus la dezvoltarea testelor moleculare care înlocuiesc acum microscopia convențională și metodele bazate pe cultură pe scară largă . Din păcate, tehnicile moleculare actuale detectează atât bacteriile vii, cât și cele moarte, iar un rezultat pozitiv nu implică viabilitatea agentului patogen. Într-adevăr, ADN-ul poate persista o perioadă lungă de timp după moartea bacteriană, iar acidul nucleic din bacteriile moarte este la fel de amplificabil. Prin urmare, testele moleculare nu sunt adecvate pentru monitorizarea tratamentului și/sau pentru controlul infecțiilor.

raportăm o abordare inovatoare pentru amplificarea selectivă a ADN-ului derivat din Mycobacterium tuberculosis viabil în probele clinice, care este utilă pentru monitorizarea încărcăturii micobacteriene la pacienții cu tuberculoză pulmonară în timpul tratamentului anti-TB.

protocolul se bazează pe tratarea prealabilă a probelor cu propidiu monoazidă (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, SUA), un compus chimic care poate intercala ADN-ul organismelor neviabile (sau deteriorate de membrană), dar este exclus din bacteriile viabile. După activarea luminii, PMA se leagă covalent de ADN, împiedicând amplificarea acestuia prin PCR . După expunerea la lumină, PMA nelegat nu este capabil să interacționeze în continuare cu moleculele de ADN.

testul a fost mai întâi optimizat folosind bacili acid-rapizi (AFB)-probe de spută negative cu vârfuri cu micobacterii moarte sau vii la diferite concentrații. Pe scurt, celulele vii Mycobacterium fortuitum au fost adăugate la probele de spută decontaminate N-acetil-cisteină negative pentru AFB prin microscopie frotiu la o concentrație finală de 106 bacterii·mL−1. O alicotă din această probă de laborator a fost tratată pentru a ucide celulele M. fortuitum. Soluția stoc PMA a fost preparată și depozitată la -20cc și protejată de expunerea la lumină, până la utilizare, conform recomandărilor producătorilor. PMA s-a adăugat ca pretratare la o concentrație finală de 500 MMC și s-a incubat timp de 30 min la 4 mmc în întuneric, urmată de expunerea la lumină cu diodă emițătoare de lumină albastră (LED)-lumină activă (GenIUL, Terrassa, Spania) timp de 15 min la temperatura camerei. ADN-ul a fost apoi extras folosind o procedură standard de cloroform fenol. Ca un control pentru a evalua eficacitatea etapei de expunere la lumină, o alicotă de ADN gol extras dintr-o cultură M. fortuitum a fost tratată cu 500 de Centimetre PMA expuse anterior la lumina LED timp de 15 minute. S-a efectuat apoi testul comercial linie-sondă (genotip Xcccm Mycobacterium; Hain Lifescience, Nehren, Germania) în vederea identificării speciilor micobacteriene relevante din punct de vedere clinic . Eșantioane care conțin M. fortuitum a prezentat un profil normal de hibridizare pe o bandă de nitroceluloză, în timp ce probele tratate pentru a ucide bacteriile nu au prezentat nicio amplificare, cu excepția controlului intern (datele nu sunt prezentate). Deoarece ADN-ul gol tratat cu PMA inactivat la lumină a prezentat un profil normal de hibridizare, etapa de expunere la lumină a fost eficientă și PCR nu a mai fost inhibată de PMA reziduală.

după optimizarea Protocolului de inactivare a ADN-ului derivat din bacterii moarte, l-am adaptat la testul automatizat Xpert XV MTB / RIF (Cepheid, Sunnyvale, CA, SUA). PCR-ul în timp real realizat de MTB/RIF Xpert-uri oferă cicluri de prag (Ct) care pot fi utilizate pentru a calcula diferența de randament de amplificare între probele cu și fără pretratare PMA (CTF): un nivel scăzut de CTF indică prezența ADN-ului amplificabil din bacterii vii, în timp ce un nivel ridicat de CTF indică faptul că ADN-ul țintă din probă provine de la bacterii moarte sau deteriorate și, prin urmare, pretratarea PMA afectează semnificativ amplificarea acestuia. Pentru a calcula valoarea XCT s-a luat în considerare media dintre valorile Ct prevăzute pentru fiecare sondă inclusă în testul Xpert XT MTB/RIF (de la A la E) .

am testat protocolul PMA folosind testul Xpert MTB/RIF pe o curbă de calibrare Ct a probelor clinice AFB-negative cu micobacterii ucise de căldură / vii adăugate în diferite rapoarte. Raporturile ridicate mort-viu au avut ca rezultat o diferență maximă a valorilor Centict între porțiunile tratate termic și cele vii cu PMA, în timp ce probele care conțin un procent similar de bacterii ucise și vii nu au putut fi diferențiate unele de altele prin utilizarea pretratării PMA (datele nu sunt prezentate). Date similare au fost raportate de Kralik și colab. .

în cele din urmă, am testat abordarea pe probe clinice. 10 pacienți diagnosticați cu tuberculoză pulmonară activă (frotiu de spută pozitiv și cultură pozitiv) au fost incluși în primul studiu de validare. Probele au fost colectate la momentul diagnosticului (t0) și după 10-20 de zile de tratament (t1), N-Acetil-Cisteina decontaminată și prelucrată pentru cultura lichidă MGIT-960 (bd Diagnostic Systems, Sparks, MD, SUA) conform ghidurilor internaționale . Toți pacienții au fost încă AFB-pozitivi prin microscopia frotiului de spută la t1. În paralel, au fost prelucrate pentru analiză moleculară 250 unqq de probe decontaminate prin testul Xpert MTB/RIF cu și fără pretratament PMA. Eșantioanele au fost apoi prelucrate conform recomandărilor producătorului pentru testul Xpert XV MTB/RIF.

după cum se arată în Figura 1, PMA nu a afectat în mod semnificativ randamentul PCR al probelor colectate la t0 (media sem 2.3 0.5), în timp ce probele colectate în timpul tratamentului la t1 au prezentat un XIF de 10.5 0.9 (p=0.0003) confirmând că pozitivitatea frotiului sputei acestor probe s-a datorat în mare parte bacteriilor puternic deteriorate. Mai mult decât atât, s-a constatat că, în probele netratate cu PMA, s-a calculat un nivel prea scăzut al cantității de T0 și t1 (2,9,0,9) pentru a aprecia o scădere reală a încărcăturii bacteriene datorată terapiei.

doi pacienți evaluați „scăzut” la t0 de către Xpert XV au prezentat o cultură negativă la t1, în timp ce toți ceilalți pacienți evaluați „mediu” sau „ridicat” au rămas culturi pozitive de către MGIT. Deși un timp exact până la pozitivitate nu poate fi evaluat, am observat că culturile din probele colectate la t1 au devenit pozitive aproximativ 7-10 zile mai târziu comparativ cu culturile din probele colectate la t0, sugerând o reducere severă a încărcăturii bacteriene vii.

toți pacienții au fost tratați și vindecați cu succes la sfârșitul terapiei, iar acest lucru a fost în concordanță cu reducerea bacteriilor vii detectate prin testul PMA.

ca martor negativ, am inclus retrospectiv și un caz de eșec al tratamentului (AFB pozitiv și cultură pozitiv după 5 luni de tratament standard). În acest caz, pretratamentul PMA al ambelor probe de spută decontaminate colectate la 1 lună și două în timpul tratamentului nu a afectat semnificativ randamentul PCR (XCT XCT 2), susținând astfel ineficiența tratamentului anti-TB.

același protocol ar trebui, în principiu, să fie compatibil cu alte teste moleculare aprobate de CE și teste de sondă de linie aprobate de Organizația Mondială a Sănătății pentru diagnosticul tuberculozei; sunt necesare studii suplimentare pentru a exclude această posibilitate.

studiile anterioare au demonstrat posibilitatea utilizării PMA pentru a face distincția între micobacteriile vii și cele moarte folosind o concentrație de 25-50 MMC. În timpul stabilirii protocolului, s-a evitat în totalitate amplificarea ADN-ului derivat de la M. fortuitum ucis de căldură, la o concentrație finală de 100 MMC; s-a observat un fond slab datorat amplificării ADN-ului de la M. tuberculosis ucis de căldură (datele nu sunt prezentate). Putem specula că compoziția diferită a peretelui celular afectează cumva capacitatea PMA de a penetra micobacteriile deteriorate. Într-adevăr, Kralik și colab. observat că reducerea semnalului indusă de PMA între vii și morți Mycobacterium avium subsp. paratuberculoza au fost mai mici comparativ cu cele găsite pentru alte specii bacteriene. În plus, având în vedere cantitatea de resturi care ar putea sechestra moleculele de PMA în sputa decontaminată, am crescut concentrația finală la 500 de metri cubi. Studii suplimentare care evaluează diferențele de efect al tratamentului PMA asupra tulpinilor care prezintă o compoziție diferită a peretelui celular (de exemplu tulpini de Beijing) și/sau în sputa cu caracteristici diferite (de exemplu. sputa care conține sânge) ar putea elucida mai bine utilitatea acestui test în diferite setări clinice.

în conformitate cu L Oktivvdal și colab. , o mică parte din celulele presupuse a fi moarte sau grav rănite nu sunt capabile să crească. Prezența unui număr mic de celule care sunt grav rănite, dar neculturabile, ar putea explica de ce avem încă un semnal pozitiv în probele colectate la t1, în ciuda pre-tratamentului PMA. Pre-tratamentul cu PMA nu evită detectarea unei mici proporții de celule moarte (fals pozitive pentru un test de viabilitate): prin urmare, testul ar putea supraestima micobacteriile viabile. Cu toate acestea, din perspectivă clinică, aceasta ar reprezenta o eroare minoră în comparație cu riscul (foarte mic pentru acest test) de subestimare a micobacteriilor viabile.

datele noastre indică, pentru prima dată, că tehnicile moleculare cantitative combinate cu metoda PMA ar putea fi o alternativă la microscopia directă și cultura pentru monitorizarea răspunsului la tratament precoce și pentru evaluarea preliminară a regimurilor personalizate. Utilizarea acestui test poate permite evaluarea anterioară a eficacității tratamentului, arătând o scădere clară a încărcăturii micobacteriene vitale. Cu toate acestea, absența răspunsului la terapie ar putea fi, de asemenea, identificată prompt prin test, permițând o schimbare a regimului și limitând răspândirea infecției și dezvoltarea ulterioară a rezistenței .

• 2 ERS 2012