PMC

pauzele cu două catene din ADN pot face ravagii în celule dacă nu sunt reparate. Prin urmare, s-a propus ca capetele cromozomilor să fie structuri de capac specializate care nu sunt recunoscute ca pauze cu două catene, prevenind astfel oprirea ciclului celular, degradarea și fuziunea recombinațională (Muller, 1938; McClintock, 1939). Acum știm că telomerii cuprind capetele cromozomilor și sunt esențiali pentru stabilitatea genomului. Telomerii sunt compuși din repetări tandem cap-la-coadă ale unei secvențe scurte bogate în G; de exemplu, telomerii umani sunt 2-20 kb de (TTAGGG)n repetări. Capetele cromozomului nu sunt contondente, iar capătul 3′ (Catena bogată în G) se suprapune într-o singură catenă care poate invada interiorul telomerului pentru a deplasa secvența internă bogată în G și a forma o structură cu buclă T (Griffith și colab., 1999; Cesare și colab., 2003; Doksani și colab., 2013), protejând astfel capetele cromozomului de a fi recunoscute de celulă ca pauze cu două catene, pe lângă protecția prin proteine care leagă telomerii.

cromozomii Eucarioți sunt duplicați prin replicare semiconservativă cu un fir de alungire (sinteză continuă pentru creșterea netă la capătul 3′ al catenei de conducere în curs de formare) și cu întârziere (sinteza fragmentului Okazaki discontinuu pentru creșterea netă la capătul 5′ al catenei de întârziere în curs de formare) așa cum se arată în Fig. 1. În replicarea semiconservativă cromozomială, primerul scurt de ARN 5′ este îndepărtat din catena în curs de formare și golul este completat de ADN care este legat de ADN-ul în curs de formare adiacent. Cu toate acestea, la sfârșitul cromozomului, decalajul după îndepărtarea primerului ARN terminal 5′ de pe firul rămas nu poate fi completat, iar cromozomul poate deveni mai scurt cu fiecare rundă de replicare care urmează. Aceasta a fost denumită problema replicării finale (Watson, 1972; Olovnikov, 1973), iar telomeraza ajută la rezolvarea acestei probleme (Greider și Blackburn, 1987; Soudet și colab., 2014).

replicarea Semiconservativă are loc înainte de acțiunea telomerazei. Anterior, se credea că replicarea ADN-ului a început la o origine în ADN-ul cromozomial adiacent repetărilor telomerilor, furcile de replicare deplasându-se bidirecțional departe de originea subtelomerică (Fig. 1 A), replicând astfel telomerul. Cu toate acestea, întrebarea a rămas dacă replicarea ADN-ului ar putea iniția cu o anumită frecvență în telomerul însuși (Fig. 1 B). Această întrebare a primit acum răspuns afirmativ în acest număr de Drosopoulos și colab., care a folosit analiza cu o singură moleculă a ADN-ului replicat (SMARD; Norio și Schildkraut, 2001). În această abordare, celulele replicatoare sunt etichetate secvențial de doi analogi nucleotidici diferiți care sunt identificați ulterior prin imunofluorescență. De exemplu, în replicarea bidirecțională, semnalele roșii de la primul impuls vor fi flancate la fiecare capăt de semnale verzi de la al doilea impuls. Rapoartele anterioare folosind SMARD au concluzionat că majoritatea replicării inițiază în regiunile subtelomerice din genomul șoarece și uman și rareori în telomerii înșiși (Sfeir și colab., 2009; Drosopoulos și colab., 2012). În studiul recent realizat de Drosopoulos și colab. (2015), hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) folosind sonde din regiunea telomerilor a permis analiza modelului de replicare pentru un segment genomic de 320 kb de la capătul brațului cromozomului de șoarece 14Q. datorită timpului lung (4 h) pentru primul impuls (roșu), de obicei s-au văzut doar tracturi roșii de semnal în interiorul telomerilor, dar din moment ce multe astfel de molecule nu au avut semnalul roșu extins în regiunea subtelomerică, se poate concluziona confortabil că replicarea trebuie să fi fost inițiată în cadrul telomerilor (Fig. 1 B). Mai mult, unele molecule au avut semnal roșu în telomer flancat de semnal verde, susținând această concluzie. Deși în aceste cazuri a existat semnal verde cromozom-proximal, semnalul verde cromozom-distal a fost rar văzut. Astfel, deși au existat dovezi limitate pentru replicarea bidirecțională originară din telomer, este foarte clar că o origine de replicare poate exista în telomerul propriu-zis cu o furcă de replicare care se extinde în timp în subtelomer. Rămâne de investigat dacă replicarea inițiază la o frecvență relativ ridicată în telomerii cromozomilor, alții decât 14Q.

aceste constatări ridică întrebarea dacă originea replicării ADN coincide cu repetarea secvenței simple Găsită în telomeri sau, în schimb, dacă coincide cu o altă secvență care ar putea fi intercalată în telomeri. Primul este sugerat de un studiu cu extracte fără celule Xenopus care ar putea asambla complexul de pre-replicare și ar putea suferi o replicare a ADN-ului pe ADN exogen care conține exclusiv repetări telomerice (Kurth și Gautier, 2010). Concluzii similare pe care replicarea ADN-ului le poate iniția în repetările simple ale ADN-ului găsite în centromere unde au fost observate bule de replicare în Drosophila virilis prin microscopie electronică au fost atinse (Zakian, 1976), iar un studiu recent sugerează că replicarea ADN-ului inițiază în ADN-ul Alfa-satelit uman (Erliandri și colab., 2014).

furcile de replicare se mișcă încet prin ADN-ul telomeric (Ivessa și colab., 2002; Makovets și colab., 2004; Miller și colab., 2006; Sfeir și colab., 2009) datorită stabilității termice ridicate a ADN-ului telomeric bogat în GC, precum și a tendinței sale de a forma structuri secundare stabile, cum ar fi ADN-ul G-quadruplex (G4), care poate pune probleme pentru replicarea ADN-ului (Lopes și colab., 2011; Paeschke și colab., 2011). Diverse helicaze ajută la rezolvarea acestei probleme; de exemplu, pif1 helicase ajută la relaxarea G4 (Paeschke și colab., 2013). Helicaza sindromului Bloom (BLM) și helicaza sindromului Werner (WRN) au fost, de asemenea, implicate în asistarea replicării telomerilor: BLM suprimă telomerii fragili dependenți de replicare (Sfeir și colab., 2009), iar WRN suprimă defectele în sinteza firelor rămase în telomeri (Crabbe și colab., 2004). Drosopoulos și colab. (2015) raportează acum că sinteza principală a catenei care inițiază în telomeri are o rată mai lentă de progresie în subtelomeri în celulele cu deficit de BLM, așa cum este vizualizată de SMARD. Mai mult, a existat o frecvență mai mare de inițiere a replicării în subtelomerii 14q ai celulelor cu deficit de BLM, originare mai aproape de telomeri decât în celulele cu experiență în BLM. Aceste observații sugerează că originile de replicare latente în subtelomerii 14q pot fi activate atunci când progresia furcii este împiedicată în celulele cu deficit de BLM (Fig. 1 C). Drosopoulos și colab. (2015) a constatat, de asemenea, o creștere a inițierii replicării subtelomerice atunci când progresia furcii de replicare din telomer a fost împiedicată de aphidicolin, ca mijloc alternativ de activare a originilor latente prin stresul de replicare. Când celulele au fost tratate cu stabilizatorul G4 PhenDC3, arderea de origine subtelomerică 14q a crescut și mai mult în celulele cu deficit de BLM. În mod colectiv, datele sugerează o încetinire a progresiei sintezei catenei principale de la o origine în telomerul 14Q (folosind Catena parentală bogată în G ca șablon) atunci când structurile G4 nu pot fi rezolvate în celulele cu deficit de BLM. Ca suport suplimentar pentru rolul helicazei BLM de a elimina structurile G4, a existat o colorare crescută în celulele cu deficit de BLM de către anticorpul BG4 (Biffi și colab., 2013) împotriva G4 în întregul genom și în special în telomeri.

WRN helicase poate relaxa G4 in vitro (Fry și Loeb, 1999; Mohaghegh și colab., 2001). Când Drosopoulos și colab. (2015) au folosit SMARD pentru a analiza replicarea în celule cu deficit dublu atât de BLM, cât și de WRN, au găsit o scădere marcată a semnalului de replicare roșie în telomerii 14Q, sugerând o suprapunere funcțională între BLM și WRN în ceea ce privește sinteza catenei de conducere de pe catena bogată în G a telomerilor. Susținând această concluzie, a existat mai multă colorare G4 de către anticorpul BG4 în celulele cu deficit dublu de BLM și WRN decât în celulele cu deficit de doar BLM sau doar WRN. Aceasta este prima demonstrație directă in vivo a unei contribuții a helicazelor BLM și WRN în rezoluția structurilor G4, care este necesară în special pentru progresia sintezei catenei principale care inițiază în telomeri și este copiată din catena bogată în G.