Reconocimiento Molecular por Ajuste Inducido: ¿Cómo encaja el Concepto?

Prácticamente todos los fenómenos biológicos dependen de una forma u otra del reconocimiento molecular específico. A finales del siglo XIX, Emil Fischer acuñó su famosa analogía de llave en mano para describir la especificidad de las reacciones enzimáticas, que son una premisa molecular de la vida (4). Se consideró que la enzima era una plantilla rígida en la que el sustrato tenía que caber como llave en una cerradura. Con los años, sin embargo, se hizo evidente que un ajuste rígido entre estructuras moleculares preformadas no puede explicar todos los aspectos de la catálisis enzimática. Por ejemplo, ¿por qué un sustrato más pequeño no debería caber en el sitio activo de una enzima diseñada para un sustrato más grande? ¿O por qué algunas enzimas son altamente selectivas, pero otras pueden acomodar varias moléculas de sustrato estructuralmente diferentes?

Es en este contexto que, hace más de 40 años, Daniel Koshland formuló el concepto de ajuste inducido (7). Para facilitar la reacción enzimática en ausencia de un ajuste preciso, postuló que «el sustrato puede causar un cambio apreciable en la relación tridimensional de los aminoácidos en el sitio activo» (7). La idea de un ajuste preciso se mantuvo en la imagen de bloqueo y llave, pero se afirmó explícitamente que el ajuste «ocurre solo después de los cambios inducidos por el propio sustrato» (énfasis original). El concepto pronto se convirtió en conocimiento de libro de texto y desde entonces se ha utilizado para explicar todo tipo de procesos de reconocimiento molecular mucho más allá de las reacciones de sustrato enzimático. De hecho, el análisis estructural de biomoléculas interactuantes ha establecido una y otra vez que un complejo y sus moléculas de componentes libres pueden diferir en detalles finos de la estructura, en apoyo aparente del reconocimiento por ajuste inducido. Un buen ejemplo de ello son varios complejos antígeno-anticuerpo para los que se ha demostrado la adaptación espacial mediante análisis de estructuras cristalinas de alta resolución (2). La plasticidad estructural también es evidente en otras interacciones proteína-proteína (12).

¿Por qué se debe cuestionar un concepto tradicional? Mi razón es que el modelo de ajuste inducido a menudo está demasiado listo para explicar por qué interactúan moléculas sin complementariedad estructural aparente. El problema radica en la suposición original de que un ajuste favorable se desarrolla solo después de la unión inicial, que a menudo se toma demasiado literalmente. Teniendo en cuenta la cinética y la termodinámica de una reacción de unión, el ajuste inducido es posible solo si la coincidencia entre los sitios que interactúan es lo suficientemente fuerte como para proporcionar la resistencia y longevidad inicial lo suficientemente complejas para que el ajuste inducido tenga lugar en un tiempo razonable. Deseo ilustrar este punto crucial con un simple cálculo de modelo basado en el ciclo termodinámico que se muestra en la Fig. 1. Considere las moléculas A y B, que pueden ser enzimas y sustratos, antígenos y anticuerpos, hormonas y receptores, o cualquier otro par de moléculas que interactúen. En aras de la simplicidad, también asumo que el ajuste inducido ocurre solo en la molécula B, que se cambia a B* para formar el complejo estable AB*. (Esta suposición no afecta el resultado del cálculo, pero simplifica el formalismo matemático.) La unión por ajuste inducido se describe en las reacciones 1 y 2 de la Fig. 1. En la reacción 1, A y B interactúan para formar el complejo inicial AB, que es un par de moléculas poco unidas. Interacciones precisas y energéticamente favorables se forman después en la reacción 2, en la que B es forzada a la conformación B* por ajuste inducido. La energía para «tirar» y «empujar» de B en la conformación del accesorio se origina en el ajuste optimizado logrado en el complejo final AB*. La constante de unión general para el complejo AB* es K = K1 × K2 = k1 × k2/k–1 × k–2 (ver Fig. 1 para definiciones de constantes de unión y constantes de velocidad cinética).

Como ejemplo práctico, visualice un complejo antígeno-anticuerpo para el que K normalmente es del orden de 108 M–1. Dado que la reacción 1 es desfavorable, tomo K1 como 1 M–1, de lo que se deduce que K2 = 108 M–1. Debido a que K2 >> K1, el equilibrio está bien en el lado del complejo antígeno-anticuerpo AB*. Por ejemplo, si un anticuerpo de 1 × 10-6 M reacciona con un antígeno de 1 × 10-6 M, el equilibrio termodinámico es del 91% en el lado del complejo antígeno-anticuerpo (calculado a partir de K = 108 M–1 y total = total = 1 × 10-6 M, donde los corchetes indican la concentración). La pregunta importante, que a menudo se pasa por alto, es cuánto tiempo tomará alcanzar esta concentración de equilibrio. El curso del tiempo es descrito por

1

2

Para calcular el tiempo para alcanzar el equilibrio, se necesitan estimaciones razonables de k1 y k2 (k–1 y k–2 se derivan de los valores elegidos de K1 y K2; ver Fig. 1). La velocidad de formación de un complejo muy débil puede estar entre 102 y 106 M–1•s–1. Elijo k1 = 104 M•1 * s–1; sin embargo, el valor de k1 no tiene mucho efecto en el resultado del cálculo. Los cambios conformacionales en las proteínas tienen medias veces de milisegundos, por lo que elijo k2 = 102 s–1 (medio tiempo = 7 ms, de ln2/k2). Los valores correspondientes de la parte posterior reacciones son, entonces k–1 = 104 s–1 y k–2 = 10-6 s–1. La integración numérica de las ecuaciones 1 y 2 para las constantes de velocidad anteriores y las concentraciones iniciales de antígeno y anticuerpo de 1 × 10-6 M da un medio tiempo para la formación del complejo antígeno-anticuerpo de ~2,5 h. Por lo tanto, alcanzar el equilibrio toma ~1 día (~10 medias veces). La razón de este largo tiempo de reacción es que, una vez formado, el complejo antígeno-anticuerpo inestable AB tiene una probabilidad muy pequeña de experimentar la transición de ajuste inducido al complejo antígeno-anticuerpo estable AB*. El ajuste inducido, aunque termodinámicamente razonable, es demasiado lento para ser significativo como reacción biológica.

La selección conformacional es una alternativa al ajuste inducido

Otros investigadores, incluido yo mismo (1, 3, 5, 8, 13, 14) han señalado que existe un mecanismo alternativo al ajuste inducido. La esencia de la selección conformacional, descrita por las reacciones 3 y 4 de la Fig. 1, es que el cambio de conformación no se supone que ocurra después de la unión inicial. Esta es una suposición bastante obvia. Tome el complejo antígeno-anticuerpo AB*. Se disocia en anticuerpo libre A y antígeno libre B * a través de la reacción 4. Por lo tanto, B* ocurre de forma aislada, aunque puede ser solo una conformación minoritaria de corta duración, que se equilibra rápidamente con la conformación principal B a través de la reacción 3. Para calcular cuánto tiempo se tarda en alcanzar la concentración de equilibrio de AB * por selección conformacional, asumo que una de cada mil moléculas está en conformación B* (K3 = 10-3). De ello se deduce que K4 = 1011 M–1 desde el ciclo termodinámico de la Fig. 1 debe satisfacerse de acuerdo con K1 × K2 = K3 × K4 = K = 108 M-1. Asumo además que el cambio conformacional B → B * es tan rápido como el ajuste inducido (k2 = k3 = 100 s–1). Además, se necesita un valor de la tasa de asociación de B* con A en la reacción 4. Las constantes de velocidad medidas para la unión antígeno-anticuerpo están en el rango de 104-107 M•1 * s–1 (8, 9, 11). Elijo un valor medio de k4 = 106 M–1•s–1. En estas condiciones, la formación del complejo antígeno-anticuerpo AB* a través de las reacciones 3 y 4 tiene un tiempo de descanso de solo 80 s; la concentración de equilibrio de AB* se alcanza en <15 min.

Estos cálculos demuestran que la unión por ajuste inducido solo tiene sentido si existe un cierto grado de complementariedad preexistente entre las especies que interactúan; de lo contrario, el complejo AB inicial tiene una vida demasiado corta (una suposición implícita en el documento inicial de Koshland). Usando las constantes de velocidad de avance k1 y k2 y concentraciones iniciales de 1 × 10-6 M, se encuentra que K1 tiene que ser ~104 M–1 para alcanzar el mismo tiempo de descanso de 80 s para la vía de ajuste inducida que para la vía de selección conformacional.

Demostración experimental de la unión por selección conformacional

Sorprendentemente, pocos estudios han intentado mostrar la selección conformacional a pesar del hecho de que es más fácil demostrarla que el ajuste inducido(1, 5, 8, 15). Para demostrar el ajuste inducido, uno tendría que tomar muestras de información estructural a lo largo de la reacción de unión, una tarea bastante difícil. Para demostrar la selección conformacional, hay que demostrar que la tasa de formación del complejo AB* es linealmente proporcional a la concentración del conformador de ajuste B* y no linealmente proporcional a la concentración total de B + B*. Si se puede medir la reacción de equilibrio conformacional 3 en ausencia del compañero de unión A, se puede calcular la concentración de B* y predecir la velocidad total de formación de AB*.

Un ejemplo bien estudiado es la reacción del fragmento de anticuerpo de cadena única dirigido contra el péptido que contiene prolina larga de 33 residuos GCN4-7P14P, llamado péptido P para abreviar (6). El péptido es muy similar en secuencia al dominio de cremallera de leucina del activador transcripcional de levadura GCN4, excepto que no forma una cremallera de leucina porque contiene dos residuos de prolina. (Las prolinas no son compatibles con la conformación helicoidal de una cremallera de leucina, que es un dímero de hélices enrolladas entre sí. Sin embargo, el anticuerpo reacciona de forma cruzada con la cremallera de leucina GCN4, y esta reacción cruzada sigue claramente una vía de selección conformacional. El anticuerpo reacciona con el péptido desplegado, que se suministra desde la cremallera de leucina doblada (reacción 3). Comparando la reacción original del anticuerpo con el péptido P con la reacción cruzada con la cremallera de leucina GCN4, se espera que la reacción cruzada sea más lenta ya que el anticuerpo tiene que seleccionar una pequeña cantidad de péptido desplegado en equilibrio con una gran cantidad de cremallera de leucina plegada. Además, la velocidad de la reacción cruzada con la cremallera de leucina predominantemente plegada mostrará una dependencia no lineal de la concentración total de antígeno, pero una dependencia lineal de la concentración de la pequeña cantidad de péptido desplegado (8, 15). Este no sería el caso de un mecanismo de ajuste inducido, que debería ser bifásico, con la primera fase correspondiente a una reacción de asociación bimolecular cuya velocidad depende linealmente de la concentración total del antígeno y la segunda fase a un reordenamiento conformacional independiente de la concentración. La figura 2 muestra los datos reales. La velocidad de formación del complejo antígeno-anticuerpo depende linealmente de la concentración de la pequeña cantidad de péptido desplegado y no linealmente de la concentración total de antígeno (Fig. 2A). La Figura 2B muestra las trazas cinéticas de la reacción más rápida con el antígeno original y la reacción más lenta con la cremallera de leucina GCN4. Sin embargo, la selección conformacional de la cremallera de leucina desplegada sigue siendo órdenes de magnitud más rápida que una vía de ajuste inducido debido a la unión del anticuerpo a la cremallera de leucina doblada (reacción 1 de la Fig. 1) es extremadamente débil (1).

El modelo de paisaje energético de conformación de proteínas

Las proteínas plegadas no tienen una estructura única, pero son mejor consideradas como un gran conjunto de estructuras similares con contenidos de energía similares. Estos llamados conformadores están en rápida fluctuación entre sí (10). Si el panorama energético es suave, los muchos conformadores se intercambian rápidamente. Si es resistente, el conjunto puede incluir conformadores que pueden ser bastante diferentes e intercambiarse más lentamente. Por lo tanto, la selección entre las estructuras B y B* es una vista extremadamente simplificada. En realidad, se parece más a una selección entre muchas estructuras más o menos ajustadas (13). Sin embargo, el resultado final de la selección conformacional es el mismo: aquellos conformadores que muestran el mejor ajuste se unen mejor.

Conclusiones

La selección conformacional es una alternativa valiosa al ajuste inducido. Esto no quiere decir que la unión por ajuste inducido no ocurra. En realidad, una combinación de selección conformacional y ajuste inducido parecería ser la mejor descripción de la interacción entre moléculas que aparentemente no encajan de manera óptima para empezar. Podemos imaginar la selección entre estructuras parcialmente ajustadas seguidas de pequeños reajustes al complejo estable final (que de acuerdo con la teoría del paisaje es en sí un conjunto de conformadores similares). El punto principal es que el ajuste inducido no puede ser una cura para todo, como a menudo se pretende en la literatura. El ajuste inducido requiere alguna coincidencia molecular previa para proporcionar suficiente afinidad antes de la adaptación conformacional. Si no se cumple esta condición, el ajuste inducido conduce a un cuello de botella cinético, incluso si la reacción general es termodinámicamente factible.