Molekylær Anerkjennelse ved Indusert Passform: Hvor Passform Er Konseptet ?

Nesten alle biologiske fenomener avhenger på en eller annen måte av spesifikk molekylær anerkjennelse. På slutten Av Det 19. århundre skapte Emil Fischer sin berømte lås-og-nøkkel-analogi for å skildre spesifisiteten av enzymreaksjoner, som er en molekylær premiss for livet (4). Enzymet ble ansett å være en stiv mal der substratet måtte passe som en nøkkel inn i en lås. Gjennom årene ble det imidlertid klart at en stiv passform mellom preformede molekylære strukturer ikke kan forklare alle aspekter av enzymkatalyse. For eksempel, hvorfor skal et mindre substrat ikke passe inn i det aktive stedet for et enzym designet for et større substrat? Eller hvorfor er noen enzymer svært selektive, men andre kan imøtekomme flere strukturelt forskjellige substratmolekyler?

Det er i denne sammenheng At Daniel Koshland for over 40 år siden formulerte begrepet indusert passform (7). For å lette den enzymatiske reaksjonen i fravær av en presis passform postulerte han at «substratet kan forårsake en merkbar forandring i det tredimensjonale forholdet mellom aminosyrene på det aktive stedet» (7). Ideen om en presis passform ble beholdt fra lås-og-nøkkelbildet, men det ble uttalt eksplisitt at passformen «oppstår bare etter endringene indusert av substratet selv» (vekt original). Konseptet ble snart lærebok kunnskap og har siden blitt brukt til å forklare alle typer molekylær anerkjennelse prosesser langt utover enzym-substrat reaksjoner. Faktisk har strukturell analyse av interagerende biomolekyler etablert igjen og igjen at et komplekst og dets frie komponentmolekyler kan variere i fine detaljer om struktur, i tilsynelatende støtte av anerkjennelse ved indusert passform. Et godt eksempel er gitt av flere antigen-antistoffkomplekser for hvilke romlig tilpasning har blitt demonstrert ved høyoppløselig krystallstrukturanalyse (2). Strukturell plastisitet er også tydelig i andre protein-protein-interaksjoner (12).

Hvorfor skal man stille spørsmål ved et hevdvunnen konsept? Min grunn er at induced fit paragon ofte er for klar til å forklare hvorfor molekyler uten tilsynelatende strukturell komplementaritet interagerer. Problemet ligger i den opprinnelige antagelsen om at en gunstig passform utvikler seg først etter første binding,som ofte tas for bokstavelig. Med tanke på kinetikken og termodynamikken til en bindende reaksjon, er indusert passform bare mulig hvis kampen mellom de samspillende stedene er sterk nok til å gi den første komplekse nok styrke og levetid, slik at indusert passform finner sted innen rimelig tid. Jeg ønsker å illustrere dette avgjørende punktet ved en enkel modellberegning basert på den termodynamiske syklusen vist I Fig. 1. Tenk molekyler A Og B, som kan være enzym og substrat, antigen og antistoff, hormon og reseptor, eller andre par av samvirkende molekyler. For enkelhets skyld antar jeg også at den induserte passformen bare skjer i molekyl B, som endres Til B * for å danne det stabile komplekset AB*. (Denne antagelsen påvirker ikke resultatet av beregningen, men forenkler matematisk formalisme.) Binding ved indusert passform er beskrevet ved reaksjoner 1 Og 2 I Fig. 1. I reaksjon 1 interagerer A og B for å danne det første komplekse AB, som er et løst bundet par molekyler. Presise og energisk gunstige interaksjoner dannes etterpå i reaksjon 2, Hvor B blir tvunget Inn i konformasjon B * ved indusert passform. Energien For å» trekke «Og» skyve » Av B inn i monteringskonformasjonen stammer fra den optimaliserte passformen som oppnås i det endelige komplekset AB*. Den totale bindingskonstanten for kompleks AB* er K = K1 × K2 = k1 × k2/k–1 × k-2(Se Fig . 1 for definisjoner av bindingskonstanter og kinetiske hastighetskonstanter).

som et praktisk eksempel, forestille seg et antigen-antistoff kompleks Som K typisk er i størrelsesorden 108 M–1. Siden reaksjon 1 er ugunstig, tar Jeg K1 til å være 1 M-1, hvorfra Det følger At K2 = 108 M–1. Fordi K2 >> K1, er likevekten godt på SIDEN AV antigen-antistoffkomplekset AB*. Dersom for eksempel 1 × 10-6 m antistoff reagerer med 1 × 10-6 m antigen, er den termodynamiske likevekten 91% på siden av antigen-antistoffkomplekset (beregnet ut Fra K = 108 M–1 og totalt = totalt = 1 × 10-6 M, der firkantede parenteser indikerer konsentrasjon). Det viktige spørsmålet, som ofte overses, er hvor lang tid det vil ta å nå denne likevektskonsentrasjonen. Tidskurset er beskrevet av

1

2

for å beregne tiden for å nå likevekt, trenger man rimelige estimater av k1 og k2 (k–1 og k–2 følger fra de valgte verdiene K1 Og K2; Se Fig. 1). Graden av dannelse av et svært svakt kompleks kan være hvor som helst mellom 102 og 106 M–1•s-1. Jeg velger k1 = 104 M•1 * s-1; verdien av k1 har imidlertid ikke mye effekt på resultatet av beregningen. Konformasjonsendringer i proteiner har halv ganger millisekunder, så jeg velger k2 = 102 s-1 (halvtid = 7 ms, fra ln2 / k2). De tilsvarende verdiene for tilbakereaksjonene er da k–1 = 104 s-1 og k–2 = 10-6 s-1. Numerisk integrasjon av ligninger 1 og 2 for de ovennevnte hastighetskonstanter og 1 × 10-6 M startkonsentrasjoner av antigen og antistoff gir en halv tid for dannelsen av antigen-antistoffkomplekset på ~2,5 h.dermed når likevekt tar ~1 dag (~10 halv ganger). Årsaken til denne lange reaksjonstiden er at det ustabile antigen-antistoffkomplekset AB, når det er dannet, bare har en svært liten sjanse til å gjennomgå den induserte passformovergangen TIL det stabile antigen-antistoffkomplekset AB*. Den induserte passformen, selv om den er termodynamisk rimelig, er for sakte til å være meningsfylt som en biologisk reaksjon.

Konformasjonsvalg er et alternativ til indusert passform

andre forskere, inkludert meg selv (1, 3, 5, 8, 13, 14) har påpekt at det er en alternativ mekanisme for indusert passform. Essensen av konformasjonsvalg, beskrevet av reaksjoner 3 og 4 I Fig. 1, er at konformasjonsendringen ikke antas å skje etter første binding. Dette er en ganske åpenbar antagelse. Ta antigen-antistoffkomplekset AB*. Det dissosierer til fritt antistoff A og fritt antigen B * gjennom reaksjon 4. Derfor forekommer B* isolert, selv om Det bare kan være en kortvarig minoritetskonformasjon, som raskt balanserer med hovedkonformasjonen B gjennom reaksjon 3. For å beregne hvor lang tid DET tar å nå likevektskonsentrasjonen AV AB* ved konformasjonsvalg, antar jeg at en av tusen molekyler er i konformasjon B* (K3 = 10-3). Det følger At K4 = 1011 M-1 siden Den termodynamiske syklusen Til Fig. 1 må være fornøyd i Henhold Til K1 × K2 = K3 × K4 = K = 108 M-1. Jeg antar videre at konformasjonsendringen B → B* er like rask som den induserte passformen (k2 = k3 = 100 s–1). Videre trenger man en verdi av assosiasjonshastigheten Til B * med a i reaksjon 4. Målte hastighetskonstanter for antigen-antistoffbinding er i området 104-107 M•1 * s–1 (8, 9, 11). Jeg velger en mellomverdi på k4 = 106 M•1 * s-1. Under disse forhold har dannelsen AV antigen-antistoffkomplekset AB* gjennom reaksjoner 3 og 4 en halvtid på bare 80 s; likevektskonsentrasjonen AV AB* oppnås i <15 min.

disse beregningene viser at binding ved indusert passform bare gir mening hvis det er en viss grad av eksisterende komplementaritet mellom de samvirkende artene; ellers er det første komplekse AB for kortvarig (en antagelse implisitt I Koshlands første papir). Ved å bruke de ovennevnte terminkonstantene k1 og k2 og 1 × 10-6 m innledende konsentrasjoner, finner Man At K1 må være ~104 M–1 for å oppnå samme halvtid på 80 s for den induserte fit-banen som for konformasjonsvalgbanen.

Eksperimentell demonstrasjon av binding ved konformasjonsvalg

Overraskende få studier har forsøkt å vise konformasjonsvalg til tross for at det er lettere demonstrert enn indusert passform (1, 5, 8, 15). For å demonstrere indusert passform må man prøve strukturell informasjon i løpet av bindingsreaksjonen, en ganske vanskelig oppgave. For å demonstrere konformasjonsvalg må man vise at graden av dannelse av komplekset AB * er lineært proporsjonal med konsentrasjonen Av passende konformator B * og ikke-lineært proporsjonal med den totale konsentrasjonen Av B + B*. Hvis man kan måle konformasjonell likevektsreaksjon 3 i fravær av bindingspartneren A, kan man beregne konsentrasjonen Av B * og forutsi den totale hastigheten for dannelse AV AB*.

et godt studert eksempel er reaksjonen av det enkeltkjedede antistofffragmentet rettet mot det 33-rester-lange prolinholdige peptidet GCN4-7P14P, kalt peptid P for kort (6). Peptidet er veldig likt i rekkefølge til leucin glidelås domenet til gjær transkripsjonell aktivator GCN4, bortsett fra at den ikke danner en leucin glidelås fordi den inneholder to prolinrester. (Prolines er ikke kompatible med spiralformet konformasjon av en leucin glidelås, som er en dimer av helices viklet rundt hverandre.) Antistoffet kryssreagerer imidlertid MED gcn4 leucin glidelåsen, og denne kryssreaksjonen følger tydelig en konformasjonsvalgvei. Antistoffet reagerer med det utfoldede peptidet, som leveres fra den foldede leucin glidelåsen (reaksjon 3). Sammenligning av den opprinnelige reaksjonen av antistoffet med peptid P til kryssreaksjonen MED leucin glidelås GCN4, forventer man at kryssreaksjonen er langsommere siden antistoffet må velge en liten mengde utfoldet peptid i likevekt med en stor mengde foldet leucin glidelås. Videre vil hastigheten av kryssreaksjonen med den overveiende foldede leucin glidelåsen vise en ikke-lineær avhengighet av den totale antigenkonsentrasjonen, men en lineær avhengighet av konsentrasjonen av den lille mengden utfoldet peptid (8, 15). Dette ville ikke være tilfelle for en indusert fit-mekanisme, som bør være bifasisk, med den første fasen som tilsvarer en bimolekylær assosiasjonsreaksjon hvis hastighet avhenger lineært av den totale antigenkonsentrasjonen og den andre fasen til en konsentrasjonsuavhengig konformasjonsreaksjon. Figur 2 viser de faktiske dataene. Graden av dannelse av antigen-antistoffkomplekset avhenger lineært av konsentrasjonen av den lille mengden utfoldet peptid og ikke-lineært på den totale antigenkonsentrasjonen (Fig. 2A). Figur 2B viser de kinetiske sporene av den raskere reaksjonen med det opprinnelige antigenet og den langsommere reaksjonen med gcn4 leucin glidelåsen. Ikke desto mindre er konformasjonsvalg av den utfoldede leucin glidelåsen fortsatt størrelsesordener raskere enn en indusert fitbane fordi binding av antistoffet til den foldede leucin glidelåsen (reaksjon 1 Av Fig. 1) er ekstremt svak (1).

energilandskapsmodellen av proteinkonformasjon

Foldede proteiner har ikke en enkelt unik struktur, men betraktes bedre som et stort ensemble av lignende strukturer som har lignende energiinnhold. Disse såkalte konformatorer er i rask svingning med hverandre (10). Hvis energilandskapet er glatt, bytter de mange konformatorene raskt. Hvis det er robust, kan ensemblet omfatte konformatorer som kan være ganske annerledes og utveksling saktere. Dermed er valget Mellom strukturene B og B* et grovt forenklet syn. I virkeligheten er det mer som et utvalg blant veldig mange flere eller mindre passende strukturer (13). Sluttresultatet av konformasjonsvalg er imidlertid det samme: de konformatorer som viser den beste passformen bind best.

Konklusjoner

Konformasjonsvalg er et verdifullt alternativ til indusert tilpasning. Dette er ikke å si at binding av indusert passform ikke forekommer. Faktisk synes en kombinasjon av konformasjonsvalg og indusert passform å være den beste beskrivelsen av samspillet mellom molekyler som tilsynelatende ikke passer optimalt til å begynne med. Vi kan se for oss valg mellom delvis tilpasningsstrukturer etterfulgt av mindre omjusteringer til det endelige stabile komplekset (som ifølge landskapsteorien selv er et ensemble av lignende konformatorer). Hovedpoenget er at indusert passform ikke kan være en kur-alt som ofte påstås i litteraturen. Indusert passform krever noen tidligere molekylær kamp for å gi tilstrekkelig affinitet før konformasjonell tilpasning. Hvis denne tilstanden ikke er oppfylt, fører indusert passform til en kinetisk flaskehals, selv om den totale reaksjonen er termodynamisk mulig.