Molecular Recognition by Induced Fit: How Fit is the Concept?

praktycznie wszystkie zjawiska biologiczne zależą w taki czy inny sposób od specyficznego rozpoznania molekularnego. Pod koniec XIX wieku Emil Fischer ukuł swoją słynną analogię „zamka i klucza”, aby zobrazować specyficzność reakcji enzymów, które są molekularną przesłanką życia [4]. Enzym był uważany za sztywny szablon,w którym substrat musiał pasować jako klucz do zamka. Z biegiem lat okazało się jednak, że sztywne dopasowanie między wstępnie uformowanymi strukturami molekularnymi nie może wyjaśnić wszystkich aspektów katalizy enzymatycznej. Na przykład, dlaczego mniejszy substrat nie mieści się w miejscu aktywnym enzymu zaprojektowanego dla większego substratu? Albo dlaczego niektóre enzymy są wysoce selektywne, ale inne mogą pomieścić kilka strukturalnie różnych cząsteczek substratu?

w tym kontekście ponad 40 lat temu Daniel Koshland sformułował koncepcję dopasowania indukowanego (7). Aby ułatwić reakcję enzymatyczną przy braku precyzyjnego dopasowania, postulował on, że „substrat może powodować znaczną zmianę w trójwymiarowej relacji aminokwasów w miejscu aktywnym” (7). Idea precyzyjnego dopasowania została zachowana z obrazu zamka i klucza, ale wyraźnie stwierdzono, że dopasowanie „występuje tylko po zmianach wywołanych przez samo podłoże” (emphasis original). Koncepcja ta szybko stała się podręcznikową wiedzą i od tego czasu została wykorzystana do wyjaśnienia wszelkiego rodzaju procesów rozpoznawania molekularnego daleko poza reakcjami enzymatyczno-substratowymi. Rzeczywiście, analiza strukturalna oddziałujących na siebie biomolekuł wykazała, że kompleks i jego wolne cząsteczki mogą różnić się drobnymi szczegółami struktury, w pozornym wspieraniu rozpoznawania przez indukowane dopasowanie. Dobrym przykładem jest kilka kompleksów antygen-przeciwciało, dla których adaptacja przestrzenna została wykazana poprzez analizę struktury krystalicznej o wysokiej rozdzielczości (2). Plastyczność strukturalna jest również widoczna w innych interakcjach białko-białko (12).

Dlaczego warto kwestionować terminową koncepcję? Moim powodem jest to, że indukowany Paragon dopasowania często jest zbyt gotowy, aby wyjaśnić, dlaczego cząsteczki bez pozornej komplementarności strukturalnej oddziałują. Problem polega na pierwotnym założeniu, że korzystne dopasowanie rozwija się dopiero po początkowym wiązaniu, co często jest traktowane zbyt dosłownie. Biorąc pod uwagę kinetykę i termodynamikę reakcji wiązania, indukowane dopasowanie jest możliwe tylko wtedy, gdy dopasowanie między oddziałującymi miejscami jest wystarczająco silne, aby zapewnić początkowy kompleks wystarczającej siły i długowieczności, tak aby indukowane dopasowanie miało miejsce w rozsądnym czasie. Chciałbym zilustrować ten kluczowy punkt za pomocą prostych obliczeń modelowych opartych na cyklu termodynamicznym pokazanym na Fig. 1. Rozważmy cząsteczki a i B, które mogą być enzymem i substratem, antygenem i przeciwciałem, hormonem i receptorem lub dowolną inną parą oddziałujących ze sobą cząsteczek. Dla uproszczenia zakładam również, że indukowane dopasowanie występuje tylko w cząsteczce B, którą zmienia się w B*, tworząc stabilny kompleks AB*. (Założenie to nie wpływa na wynik obliczeń, ale upraszcza formalizm matematyczny.) Wiązanie przez indukowane dopasowanie jest opisane w reakcjach 1 i 2 Fig. 1. W reakcji 1, A i B oddziałują tworząc początkowy kompleks AB, który jest luźno związaną parą cząsteczek. Precyzyjne i energicznie korzystne interakcje tworzą się później w reakcji 2, w której B jest zmuszony do konformacji B* przez indukowane dopasowanie. Energia do „ciągnięcia” i „pchania” B w kształt dopasowania pochodzi z optymalnego dopasowania uzyskanego w końcowym kompleksie AB*. Całkowita stała wiązania dla kompleksu AB * wynosi K = K1 × K2 = k1 × k2 / k-1 × k-2 (patrz Rys. 1 dla definicji stałych wiążących i stałych szybkości kinetycznej).

jako praktyczny przykład należy wyobrazić sobie kompleks antygen-przeciwciało, dla którego K zazwyczaj jest rzędu 108 M–1. Ponieważ reakcja 1 jest niekorzystna, biorę K1 za 1 M-1, z czego wynika, że K2 = 108 M–1. Ponieważ K2 >> K1, równowaga jest dobrze po stronie kompleksu antygen-przeciwciało AB*. Na przykład, jeśli przeciwciało 1 × 10-6 m reaguje z antygenem 1 × 10-6 m, równowaga termodynamiczna wynosi 91% po stronie kompleksu antygen-przeciwciało (obliczone na podstawie K = 108 M – 1 i total = total = 1 × 10-6 m, gdzie nawiasy kwadratowe wskazują stężenie). Ważnym pytaniem, które często jest pomijane, jest to, jak długo zajmie osiągnięcie tego stężenia równowagi. Przebieg czasu jest opisany przez

1

2

aby obliczyć czas do osiągnięcia równowagi, należy rozsądnie oszacować k1 i k2 (K–1 i k–2 wynikają z wybranych wartości K1 i K2; patrz Rys. 1). Szybkość powstawania bardzo słabego kompleksu może wynosić od 102 do 106 M–1•s-1. Wybieram k1 = 104 M-1•s-1, jednak wartość K1 nie ma większego wpływu na wynik obliczeń. Zmiany konformacyjne w białkach mają połowę czasu milisekund, więc wybieram k2 = 102 s–1 (połowa czasu = 7 ms, z ln2 / k2). Odpowiednie wartości reakcji wstecznych wynoszą wówczas k–1 = 104 s-1 i k–2 = 10-6 s–1. Numeryczna integracja równań 1 i 2 dla powyższych stałych szybkości i 1 × 10-6 m początkowych stężeń antygenu i przeciwciała daje czas połowicznego wytworzenia kompleksu antygen-przeciwciało ~2,5 h. W ten sposób osiągnięcie równowagi trwa ~1 dzień (~10 razy połowicznie). Powodem tego długiego czasu reakcji jest to, że po utworzeniu niestabilny kompleks antygen-przeciwciało AB ma tylko bardzo małą szansę na przejście indukowanego pasowania do stabilnego kompleksu antygen-przeciwciało AB*. Indukowane dopasowanie, chociaż termodynamicznie uzasadnione, jest zbyt powolne, aby mogło mieć znaczenie jako reakcja biologiczna.

wybór Konformacyjny jest alternatywą dla indukowanego dopasowania

innych badaczy, w tym mnie (1, 3, 5, 8, 13, 14) zwróciły uwagę, że istnieje alternatywny mechanizm dla indukowanego dopasowania. Istota selekcji konformacyjnej, opisana przez reakcje 3 i 4 z Fig. 1, oznacza to, że zmiana konformacji nie zachodzi po początkowym wiązaniu. Jest to dość oczywiste założenie. Weź kompleks antygen-przeciwciało AB*. Dysocjuje na wolne przeciwciało A i wolny antygen b * w reakcji 4. Stąd B * występuje w izolacji, mimo że może być tylko krótkotrwałą konformacją mniejszościową, szybko równoważąc się z konformacją główną B poprzez reakcję 3. Aby obliczyć, ile czasu zajmuje osiągnięcie stężenia równowagi AB * przez dobór konformacyjny, zakładam, że jedna na tysiąc cząsteczek ma konformację B * (K3 = 10-3). Wynika z tego, że K4 = 1011 M–1 od cyklu termodynamicznego Fig. 1 musi być spełnione zgodnie z K1 × K2 = K3 × K4 = K = 108 M–1. Dalej zakładam, że zmiana konformacyjna B → B* jest tak szybka jak indukowane dopasowanie (k2 = k3 = 100 s–1). Ponadto potrzebna jest wartość szybkości kojarzenia B* z a w reakcji 4. Zmierzone stałe szybkości wiązania antygen-przeciwciało mieszczą się w zakresie 104-107 M-1•s–1 (8, 9, 11). Wybieram średnią wartość k4 = 106 M–1•s-1. W tych warunkach tworzenie kompleksu antygen-przeciwciało AB * w reakcjach 3 i 4 mA czas połowicznego rozpadu tylko 80 s; stężenie równowagi AB * osiąga się w <15 min.

obliczenia te pokazują, że wiązanie przez indukowane dopasowanie ma sens tylko wtedy, gdy istnieje pewien stopień istniejącej wcześniej komplementarności między oddziałującymi gatunkami; w przeciwnym razie początkowy kompleks AB jest zbyt krótkotrwały (założenie ukryte w początkowym artykule Koshlanda). Korzystając z powyższych stałych szybkości forward k1 i k2 oraz początkowych stężeń 1 × 10-6 m, stwierdza się, że K1 musi wynosić ~104 m–1, aby osiągnąć ten sam czas połowicznego zaniku 80 s dla indukowanej ścieżki dopasowania, co dla ścieżki wyboru konformacyjnego.

eksperymentalna demonstracja wiązania przez selekcję konformacyjną

zaskakująco niewiele badań próbowało wykazać selekcję konformacyjną pomimo faktu, że jest ona łatwiejsza do wykazania niż indukowane dopasowanie (1, 5, 8, 15). Aby zademonstrować indukowane dopasowanie, trzeba próbkować informacje strukturalne w trakcie reakcji wiązania, co jest dość trudnym zadaniem. Aby wykazać wybór konformacyjny, należy wykazać, że szybkość tworzenia się kompleksu AB* jest liniowo proporcjonalna do stężenia dopasowanego konformatora B* i nieliniowo proporcjonalna do całkowitego stężenia B + B*. Jeśli można zmierzyć reakcję równowagi konformacyjnej 3 przy braku partnera wiążącego a, można obliczyć stężenie B* i przewidzieć całkowitą prędkość tworzenia AB*.

dobrze zbadanym przykładem jest reakcja jednołańcuchowego fragmentu przeciwciała skierowanego przeciwko peptydowi gcn4-7p14p zawierającemu 33-resztę o długości proliny, nazywanemu w skrócie peptydem P (6). Peptyd jest bardzo podobny w sekwencji do domeny zamka leucyny aktywatora transkrypcyjnego drożdży GCN4, z tym że nie tworzy zamka leucyny, ponieważ zawiera dwie reszty proliny. (Proliny nie są kompatybilne z konformacją spiralną suwaka leucyny, który jest dimerem Helis nawiniętych wokół siebie.) Jednak przeciwciało reaguje krzyżowo z suwakiem leucyny gcn4, a ta reakcja krzyżowa wyraźnie podąża drogą selekcji konformacyjnej. Przeciwciało reaguje z rozłożonym peptydem, który jest dostarczany ze złożonego zamka leucyny (reakcja 3). Porównując pierwotną reakcję przeciwciała z peptydem P do reakcji krzyżowej z suwakiem leucyny GCN4, oczekuje się, że reakcja krzyżowa jest wolniejsza, ponieważ przeciwciało musi wybrać niewielką ilość rozłożonego peptydu w równowadze z dużą ilością złożonego suwaka leucyny. Co więcej, szybkość reakcji krzyżowej z głównie złożonym zamkiem leucyny wykazuje nieliniową zależność od całkowitego stężenia antygenu, a jednocześnie liniową zależność od stężenia niewielkiej ilości rozpostartego peptydu (8, 15). Nie byłoby to w przypadku mechanizmu dopasowania indukowanego, który powinien być dwufazowy, z pierwszą fazą odpowiadającą reakcji wiązania bimolekularnego, której szybkość zależy liniowo od całkowitego stężenia antygenu, a drugą fazą do niezależnej od stężenia przegrupowania konformacyjnego. Rysunek 2 przedstawia rzeczywiste dane. Szybkość tworzenia się kompleksu antygen-przeciwciało zależy liniowo od stężenia niewielkiej ilości rozłożonego peptydu i nieliniowo od całkowitego stężenia antygenu (Fig. 2A). 2B przedstawia kinetyczne ślady szybszej reakcji z pierwotnym antygenem i wolniejszej reakcji z suwakiem leucyny gcn4. Niemniej jednak, wybór konformacyjny rozprostowanego zamka leucyny jest nadal o rząd wielkości szybszy niż szlak indukowanego dopasowania, ponieważ Wiązanie przeciwciała ze złożonym zamkiem leucyny (reakcja 1 z Fig. 1) jest bardzo słaby (1).

Model krajobrazu energetycznego konformacji białek

złożone białka nie mają jednej unikalnej struktury, ale są lepiej postrzegane jako duży zespół podobnych struktur o podobnej zawartości energii. Te tak zwane konformatory ulegają gwałtownym wahaniom (10). Jeśli krajobraz energetyczny jest gładki, wiele konformerów szybko się wymienia. Jeśli jest wytrzymały, zespół może zawierać konformery, które mogą być zupełnie inne i wymieniać się wolniej. Tak więc wybór pomiędzy strukturami B i B* jest rażąco uproszczonym widokiem. W rzeczywistości jest to raczej wybór spośród wielu bardziej lub mniej dopasowanych struktur (13). Jednak końcowy wynik selekcji konformacyjnej jest taki sam: te konformery, które wykazują najlepsze dopasowanie, wiążą się najlepiej.

wnioski

wybór Konformacyjny jest cenną alternatywą dla dopasowania indukowanego. Nie oznacza to, że wiązanie przez indukowane dopasowanie nie występuje. Właściwie, połączenie selekcji konformacyjnej i indukowanego dopasowania wydaje się być najlepszym opisem interakcji między cząsteczkami, które najwyraźniej nie pasują optymalnie na początek. Możemy sobie wyobrazić wybór pomiędzy częściowo dopasowanymi strukturami, a następnie drobne dostosowania do końcowego stabilnego kompleksu (który zgodnie z teorią krajobrazu sam w sobie jest zespołem podobnych konformerów). Głównym punktem jest to, że indukowane dopasowanie nie może być lekarstwem-wszystko, co jest często rzekomo w literaturze. Indukowane dopasowanie wymaga pewnego wcześniejszego dopasowania molekularnego, aby zapewnić wystarczające powinowactwo przed adaptacją konformacyjną. Jeśli warunek ten nie jest spełniony, indukowane dopasowanie prowadzi do kinetycznego wąskiego gardła, nawet jeśli ogólna reakcja jest wykonalna termodynamicznie.