Molecular Recognition by Induced Fit: How Fit is the Concept?

virtualmente todos os fenômenos biológicos dependem de uma forma ou de outra do reconhecimento molecular específico. No final do século XIX, Emil Fischer cunhou sua famosa analogia lock-and-key para imaginar a especificidade das reações enzimáticas, que são uma premissa molecular da vida (4). A enzima foi considerada um modelo rígido no qual o substrato tinha de encaixar como chave numa fechadura. Ao longo dos anos, no entanto, tornou-se evidente que um ajuste rígido entre estruturas moleculares pré-formadas não pode explicar todos os aspectos da catálise enzimática. Por exemplo, porque é que um substrato mais pequeno não se encaixa no local activo de uma enzima concebida para um substrato maior? Ou porque é que algumas enzimas são altamente selectivas, mas outras podem acomodar várias moléculas de substrato estruturalmente diferentes?

é neste contexto que, há mais de 40 anos, Daniel Koshland formulou o conceito do ajuste induzido (7). Para facilitar a reação enzimática na ausência de um ajuste preciso, ele postulou que” o substrato pode causar uma mudança apreciável na relação tridimensional dos aminoácidos no local ativo ” (7). A ideia de um ajuste preciso foi retida da imagem de bloqueio e chave, mas foi afirmado explicitamente que o ajuste “ocorre apenas após as mudanças induzidas pelo próprio substrato” (ênfase original). O conceito logo se tornou um conhecimento didático e desde então tem sido usado para explicar todos os tipos de processos de reconhecimento molecular muito além das reações de substrato enzimático. Na verdade, a análise estrutural das biomoléculas interagindo estabeleceu repetidamente que um complexo e suas moléculas livres componentes podem diferir em detalhes finos da estrutura, em apoio aparente do reconhecimento pelo ajuste induzido. Um bom caso em questão é fornecido por vários complexos antigénios-anticorpos para os quais a adaptação espacial foi demonstrada pela análise da estrutura cristalina de alta resolução (2). A plasticidade estrutural também é evidente noutras interacções proteína-proteína (12).por que uma pergunta deve ser um conceito honrado? Minha razão é que o modelo de ajuste induzido muitas vezes está muito pronto para explicar por que as moléculas sem complementaridade estrutural aparente interagem. O problema reside na suposição original de que um ajuste favorável se desenvolve apenas após a ligação inicial, que é muitas vezes tomado muito literalmente. Considerando a cinética e a termodinâmica de uma reação de ligação, o ajuste induzido só é possível se a combinação entre os locais de interação for forte o suficiente para fornecer a força complexa inicial e longevidade suficiente para que o ajuste induzido ocorra dentro de um tempo razoável. Gostaria de ilustrar este ponto crucial através de um simples modelo de cálculo baseado no ciclo termodinâmico mostrado na Fig. 1. Considere as moléculas A E B, que podem ser enzima e substrato, antigénio e anticorpo, hormônio e receptor, ou qualquer outro par de moléculas interagindo. Por uma questão de simplicidade, também assumo que o ajuste induzido ocorre apenas na molécula B, que é transformada em B* para formar o complexo estável AB*. (Esta suposição não afeta o resultado do cálculo, mas simplifica o formalismo matemático.) A ligação por ajuste induzido é descrita pelas reacções 1 e 2 da Fig. 1. In reaction 1, A and B interact to form the initial complex AB, which is a loosely bounded pair of molecules. Interações precisas e energeticamente favoráveis formam-se depois na reação 2, na qual B é forçado a conformação B* por ajuste induzido. A energia para “puxar” e “empurrar” de B para a conformação de montagem se origina do ajuste otimizado alcançado no complexo final AB*. A constante de ligação global para o complexo AB * é K = K1 × K2 = k1 × k2 / k–1 × k–2 (ver Fig. 1 Para definições de constantes de ligação e constantes de velocidade cinética).

Como um exemplo prático, visualize um complexo antigénio-anticorpo para o qual K tipicamente é da ordem de 108 M–1. Uma vez que a reação 1 é desfavorável, eu tomo K1 para ser 1 M–1, a partir do qual segue que K2 = 108 M–1. Como K2 >> K1, o equilíbrio está bem do lado do complexo antigénio-anticorpo AB*. Por exemplo, se um anticorpo de 1 × 10-6 M reagir com o antigénio de 1 × 10-6 M, o equilíbrio termodinâmico é de 91% no lado do complexo antigénio-anticorpo (calculado a partir de K = 108 M–1 e total = total = 1 × 10-6 M, em que os parêntesis quadrados indicam concentração). A questão importante, que é muitas vezes ignorada, é quanto tempo levará para alcançar esta concentração de equilíbrio. O curso do tempo é descrita por

1

2

Para calcular o tempo para alcançar o equilíbrio, necessidades de estimativas razoáveis de k1 e k2 (k–1 e k–2 acompanhamento de escolhidos os valores de K1 e K2; ver Fig. 1). A taxa de formação de um complexo muito fraco pode estar em qualquer lugar entre 102 e 106 M–1•s–1. I choose k1 = 104 M-1 * s-1; however, the value of k1 does not have much effect on the result of the calculation. As mudanças conformacionais nas proteínas têm meio-tempo de milisegundos, então eu escolho k2 = 102 s – 1 (meio-tempo = 7 ms, de ln2/k2). Os valores correspondentes das reações traseiras são então k–1 = 104 s–1 e k–2 = 10-6 s–1. A integração numérica das equações 1 e 2 para a taxa acima constantes e 1 × 10-6 M de partida concentrações de antígeno e anticorpo dá um meia de tempo para a formação do antígeno-anticorpo complexo de ~2,5 h. Assim, alcançar o equilíbrio leva ~1 dia (~10 meia-vezes). A razão para este longo tempo de reacção é que, uma vez formado, o complexo antigénio-anticorpo instável AB tem apenas uma possibilidade muito pequena de passar pela transição induzida para o complexo antigénio-anticorpo estável AB*. O ajuste induzido, embora termodinamicamente razoável, é muito lento para ser significativo como uma reação biológica.

a selecção conformacional é uma alternativa ao ajuste induzido

outros investigadores, incluindo eu próprio (1, 3, 5, 8, 13, 14) salientaram que existe um mecanismo alternativo para o ajuste induzido. A essência da seleção conformacional, descrita pelas reações 3 e 4 da Fig. 1, is that the conformation change is not assunted to occur after initial binding. Esta é uma suposição bastante óbvia. Tome o complexo antigénio-anticorpo AB*. Dissocia-se em anticorpos livres a e antigénio livre b* através da reacção 4. Assim, B* ocorre isoladamente, embora possa ser apenas uma conformação minoritária de curta duração, equilibrando-se rapidamente com a conformação b maior através da reação 3. Para calcular quanto tempo leva para atingir a concentração de equilíbrio de AB* por seleção conformacional, assumo que uma em cada mil moléculas está em conformação B* (K3 = 10-3). Segue–se que K4 = 1011 M-1 desde o ciclo termodinâmico da Fig. 1 deve ser satisfeito de acordo com K1 × K2 = K3 × K4 = K = 108 M-1. I further assum that the conformational change B → B* is as fast as the induced fit (k2 = k3 = 100 s–1). Além disso, é necessário um valor da taxa de associação de B* com a na reação 4. As constantes de velocidade medidas para a ligação antigénio-anticorpo situam–se no intervalo 104-107 M-1•s–1 (8, 9, 11). Eu escolho um valor médio de k4 = 106 M-1 * s-1. Nestas condições, a formação do complexo antigénio-anticorpo AB* através de reacções 3 e 4 tem um tempo de semi-Tempo de apenas 80 s; a concentração de equilíbrio de AB* é atingida em <15 min.estes cálculos demonstram que a ligação por fit induzido só faz sentido se existir uma certa complementaridade pré-existente entre as espécies que interagem; caso contrário, o complexo AB inicial é muito curto (uma suposição implícita no artigo inicial de Koshland). Usando o acima para a frente taxa de constantes k1 e k2 e 1 × 10-6 M concentrações iniciais, descobre-se que K1 tem que ser ~104 M–1 para atingir o mesmo de meia-hora de 80 s para o ajuste induzido caminho para conformacional de seleção de caminho.

demonstração Experimental de ligação por selecção conformacional

surpreendentemente poucos estudos tentaram mostrar selecção conformacional apesar do facto de ser mais facilmente demonstrado do que o ajuste induzido(1, 5, 8, 15). Para demonstrar o ajuste induzido, teria que se amostrar informação estrutural ao longo da reação de ligação, uma tarefa bastante difícil. Para demonstrar a seleção conformacional, é preciso mostrar que a taxa de formação do complexo AB* é linearmente proporcional à concentração do conformador conforme B* e não linearmente proporcional à concentração total de B + B*. Se se pode medir a reação de equilíbrio conformacional 3 na ausência do parceiro de ligação a, pode-se calcular a concentração de B* e prever a velocidade global de formação de AB*.

um exemplo bem estudado é a reacção do fragmento de anticorpo de cadeia única dirigido contra o peptídeo gcn4-7P14P contendo 33 resíduos de prolina, denominado peptídeo P para curto (6). O peptídeo é muito semelhante em sequência ao Domínio leucina zipper do activador transcriptional da levedura GCN4, excepto que não forma um fecho de leucina porque contém dois resíduos de prolina. (Prolines não são compatíveis com a conformação helicoidal de um zíper de leucina, que é um dímero de hélices ferida em torno de si.) No entanto, o anticorpo reage cruzada com o zíper da leucina gcn4, e esta reacção cruzada segue claramente uma via de selecção conformacional. O anticorpo reage com o peptídeo não dobrado, que é fornecido pela leucina zipper dobrada (reacção 3). Comparando a reacção original do anticorpo com o peptídeo P com a reacção cruzada com a leucina zipper gcn4, espera-se que a reacção cruzada seja mais lenta, uma vez que o anticorpo tem de seleccionar uma pequena quantidade de peptídeo não dobrado em equilíbrio com uma grande quantidade de folded leucine zipper. Além disso, a taxa da reacção cruzada com o fecho de leucina predominantemente dobrado mostrará uma dependência não linear da concentração total do antigénio, mas uma dependência linear da concentração da pequena quantidade de peptídeo não dobrado (8, 15). Este não seria o caso de um mecanismo de ajuste induzido, que deve ser bifásico, com a primeira fase correspondente a uma reação de associação bimolecular cuja taxa depende linearmente da concentração total do antigénio e da segunda fase para um rearranjo conformacional independente da concentração. A figura 2 mostra os dados reais. A taxa de formação do complexo antigénio-anticorpo depende linearmente da concentração da pequena quantidade de peptídeo não dobrado e não linearmente da concentração total do antigénio (Fig. 2A). A figura 2B mostra os traços cinéticos da reacção mais rápida com o antigénio original e a reacção mais lenta com o fecho de leucina gcn4. No entanto, a selecção conformacional do fecho não dobrado de leucina é ainda ordens de magnitude mais rápida do que uma via de ajuste induzido porque a ligação do anticorpo ao fecho dobrado de leucina zipper (reacção 1 da Fig. 1) é extremamente fraco (1).

A energia paisagem modelo de proteína conformação

Dobrado de proteínas não têm uma única estrutura única, mas são melhor considerados como um grande conjunto de estruturas semelhantes semelhantes conteúdo de energia. Estes chamados conformers estão em rápida flutuação uns com os outros (10). Se a paisagem energética for Lisa, os muitos conformadores trocam rapidamente. Se for robusto, o conjunto pode incluir conformadores que podem ser bastante diferentes e intercambiar mais lentamente. Assim, a seleção entre as estruturas B e B* é uma visão bastante simplificada. Na realidade, é mais como uma seleção entre muitas estruturas mais ou menos adequadas (13). No entanto, o resultado final da seleção conformacional é o mesmo: aqueles conformadores que mostram o melhor ajuste bind melhor.

conclusões

seleção conformacional é uma alternativa valiosa para o ajuste induzido. Isto não quer dizer que a ligação por ajuste induzido não ocorre. Na verdade, uma combinação de seleção conformacional e ajuste induzido parece ser a melhor descrição da interação entre moléculas que aparentemente não se encaixam perfeitamente para começar. Podemos imaginar a seleção entre estruturas parcialmente encaixantes seguidas por reajustamentos menores para o complexo estável final (que de acordo com a teoria da paisagem é em si um conjunto de conformadores similares). O ponto principal é que o ajuste induzido não pode ser uma cura-tudo como muitas vezes é dito na literatura. O ajuste induzido requer alguma correspondência molecular prévia para fornecer afinidade suficiente antes da adaptação conformacional. Se esta condição não for cumprida, o ajuste induzido leva a um gargalo cinético, mesmo que a reação global seja termodinamicamente viável.estou grato a muitos dos meus colegas do passado e do presente por discussões úteis e estimulantes.o trabalho do meu laboratório foi parcialmente apoiado pela Fundação suíça para a Ciência.