ATP sintaza (fof1-complex): informații detaliate despre enzima

ATP sintaza FAQ

această listă de Întrebări frecvente (FAQ) privind ATP sintaza este scris cu presupunerea că cititorul are unele backgroundknowledge în biochimie, enzimologie, și chimie fizică.
acesta nu este un articol de revizuire sau ceva de acest fel; nu există referințe sau credite și nici o descriere detaliată a experimentelor care se bazează pe fiecare informație. Dacă sunteți interesat în gettinginto detalii, doar scrie-mi un e-mail (feniouk atpsynthase.info) și voi fi bucuros să discut oricare dintre întrebărimai jos.
lectură recomandată se adaugă pentru unele secțiuni sub „„-semn.

cuprins

nume corect
Rolul fiziologic al ATP sintazei
Diferențele dintre F-, A-, V-, P-și e-Atpaze
arhitectura și compoziția subunității ATP sintazei
reacția catalizată
Termodinamica sintezei/hidrolizei ATP
forța motrice pentru sinteza ATP catalizată de ATP sintază.inhibitori ai ATP sintazei inhibitori ai FO inhibitori ai F1 raportul Proton / ATP locația ATP sintazei câte situs catalitic are enzima?
Cat de rapid este ATP sintaza?
translocarea protonului prin FO
Ce este secvența beta DELSEED?
Pot primi un răspuns la o întrebare care nu sunt enumerate aici?

nume corect

conform Nomenclaturii Iubmbenzimelor, enzima se numește „ATP fosfohidrolază (h+-transport)”. Cu toate acestea, denumirea”ATP sintază” reflectă mai mult funcția primară a enzimeiclar și în zilele noastre este cea mai răspândită.
celălalt nume care a fost folosit în mod obișnuit în trecut este „H+-ATPase”,uneori un „FOF1 H+-ATPase”mai precis. După descoperirea multor alteletipuri de pompe de protoni conduse de ATP, aceste nume vechi sunt mai puțin utilizate.
celelalte denumiri care au fost folosite pentru ATP sintaza sunt:
F1-ATPaza
FOF1-ATPaza
F-tip ATPaza sau pur și simplu F-ATPaza
H+-ATPaza transportoare
ATPaza mitocondrială
factori de cuplare (F0, F1și CF1)
cloroplast ATPaza
bacteriene Ca2+/Mg2+ATPaza
complexul ATP sintaza
Complexul V (cinci)

rolul fiziologic al ATP sintazei

pentru a scurta o poveste lungă, funcția principală a ATP sintazei în majoritatea organismelor este sinteza ATP. De aici și numele. Cu toate acestea, în unele cazuri reacția inversă, adică pompa de protoni transmembranarăputernic de hidroliza ATP este mai importantă. Un exemplu tipic: bacteriile anaerobe produc ATP prinfermentare, iar ATP sintaza folosește ATP pentru a genera forța protonmotivă necesară transportului ionic și motilității flagelului.
multe bacterii pot trăi atât din fermentație, cât și din respirație sau fotosinteză. În acest caz, ATP synthasefuncționează în ambele sensuri.
O problemă importantă este de a controla activitatea de pompare de protoni ATP-driven de ATP sintaza, în scopul de a evita hidroliza ATP risipitoare în condițiile în care nici o forță protonmotive pot fi generate (de exemplu, membrana leakydamaged, decuplare prezent, etc.). În acest caz,hidroliza ATP devine o problemă, deoarece poate elimina rapid piscina ATP intecelulară. Pentru a evita această situație, toate SINTAZELE ATP sunt echipate cu mecanisme de reglementare care suprimă Atpaseactivitatea dacă nu există forță protonmotivă. Gradul de inhibare a hidrolizei ATP depinde de organism. În plante (în cloroplaste), unde este necesar să se păstrezeatp piscină pe toată noaptea, inhibarea este foarte puternică: enzima are cu greu anyATPase activitate. În schimb, în bacteriile anaerobe în care ATP synhase este principalulgeneratorul forței protonmotive, o astfel de inhibiție este foarte slabă. ATP sintaza mitocondrială este undeva între ele.

diferențele dintre F-, A-, V-, P-și e-Atpaze

• „F-Type ATPase” este doar un alt nume pentru ATP sintaza; litera „F”vine de la „factorul de fosforilare”.F-Atpazele sunt prezente în bacterii, mitocondrii și cloroplaste. Funcția lor majoră în majoritatea cazurilor este sinteza ATP în detrimentul diferenței de potențial Proton transmembranar electrochimic. Cu toate acestea,la unele bacterii, funcția primară a enzimei este inversată: aceasta hidrolizează ATP pentru a genera această diferență de potențial. Atpazele de tip F in vitro potfuncționează în ambele direcții în funcție de condițiile experimentale.
  se găsesc și câteva Atpaze na + – bacteriene de tip F.
• Atpazele de tip A au fost găsite în Archaea, funcția lor este similară cu cea a ATP sintazei de tip F, dar structural sunt foarte asemănătoare cu Atpazele de tip V (vezi mai jos).
• V-tip H+-Atpaze au fost inițial găsite în vacuole eucariote. Funcția lor primară este pomparea protonului (sau Na+) condusă de ATP pentru a acidifica interiorul vacuolului.
• P-tip ATPases (uneori numit E1-E2 ATPases) pompa o varietate deiipe membrană și se găsesc în bacterii și în multe organite celulare eucariote.
• E-Tip ATPases (nu se amestecă cu E1-E2 ATPases!) este o familie de enzime care hidrolizează Extracelularatp (vezi pagina web Ecto-ATPază a lui HerbertZimmermann pentru detalii)

Atpazele de tip F, A și V sunt complexe multisubunitare, similare în termeni de arhitectură generală și, cel mai probabil, au același mecanism catalitic de bază. Eicuplu Proton transmembranar (sau Na+ în unele F-Atpaze) transport,realizat prin rotația unui anumit complex de subunități în raport cu restul enzimei, cu Atfidroliză (sau sinteză în a – și F-Atpaze).
caracteristicile comune pentru ei sunt: forma „ciupercă”, domeniul catalitic hexamerichidrofilic de tip alfa 3 Beta 3 cu subunitate Gamma în interiorul acestuia. Actul catalitic efectuat de aceste enzime nu include o enzimă fosforilatăintermediat.
porțiunea translocatoare de protoni a acestor enzime este compusă dintr-un oligomer subunitar în formă de inel (c-subunitoligomer în cazul Atpazelor de tip F); fiecare subunitate poartă o grupare carboxil extrem de importantă aproximativ în mijlocul celui de-al doilea transmembranehelix. Această grupare carboxil este direct implicată înproton translocație.
Atpazele de tip P sunt o familie destul de diferită de pompele acționate de ATP-translocatoare. Cele mai multe dintre ele sunt, de asemenea, proteine multisubunitmembranare; un f mare efectuează atât Atfidroliza, cât și pomparea ionilor. Există multe subfamilii diferite deatpaze de tip P, de obicei clasificate în funcție de ionul pe care îltransport. Sunt descrise H+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Ag+ șiag2+, Zn2+,Co2+, Pb2+,Ni2+, Cd2+, Cu+ și Cu2+ p-ATPază de pompare.
în timpul hidrolizei ATP de către o p-Atpazăîntr-o anumită etapă a ciclului catalitic, fosfatul este transferat launa dintre reziduurile Asp ale enzimei. There is no evidence (neitherstructural nor functional) for rotary catalysis in P-type ATPases.Typical examples of such enzymes are yeast plasma membrane H+ATPase, K+/Na+ membraneATPase, Ca2+ membraneATPase.

1) Pedersen, P. L., andCarafoli, E. (1987) Ion motive ATPases. I. Ubiquity, properties, andsignificance to cell function. Trends Biochem. Sci. 4:146-150. 2) P-tip ATPaseDatabase (de Kristian B. Alexsen, Institutul elvețian de Bioinformatica) 3) Kawasaki-Nishi s, Nishi T, Forgac M. (2003 ) translocare Protondriven prin hidroliza ATP în V-ATPases. FEBS Lett. 545(1): 76-85.4) Perzov N, Padler-Karavani V, Nelson H, Nelson N. (2001) caracteristici ofV-ATPases care le disting de F-ATPases. FEBS Lett. 504(3): 223-8.

arhitectura și compoziția subunității ATP sintazei

ATP sintaza este un complex proteic asimetric în formă de ciupercă. Cea mai simplă enzimă bacteriană (vezi desenul animat de mai jos) este compusă din 8 tipuri de unități, din care 5 formează porțiunea catalitică hidrofilă F1 („capacul”ciupercii). Aceste subunități sunt numite cu litere grecești (Alfa,Beta, Gamma, Delta și Epsilon) în conformitate cu greutatea lor moleculară. Porțiunea de translocare a protonilor FO este compusă dinsubunități de 3 tipuri numite A, b și c.

porțiunea catalitică a ATP sintazei (F1) se formează byalpha 3beta 3 hexamer cu subunitate gamma în interiorul acestuia și epsilonatașat la gamma. Subunitatea Delta este legată de „vârful” hexamerului și asubunităților b.segmentul transmembranar hidrofob al subunității b este în contact cu subunitatea a.Subunitățile Gamma și Epsilon din domeniul catalitic sunt legate deoligomerul în formă de inel al subunităților C.Translocarea protonilor are loc la interfața subunităților a și c.
stoichiometria subunităților este:

Chloroplast ATP synthase and the enzyme from some photosyntheticbacteriahave 2 different, although similar, b-typesubunits in the protontranslocating FO portion, anume b și b’, o copie afiecare.
omologie ridicată se găsește pentru majoritatea subunităților ATP sintază dinbacterii și cloroplaste diferite.
enzima mitocondrială este mult mai complexă; 17 tipuri diferite desubunitățile sunt descrise în acest moment. Unele dintre aceste subunități au o omologie ridicată față de omologii bacterieni și cloroplastici, în special subunitățile alfa, Beta și Gamma din porțiunea F1 și subunitățile a și c din Foport. Multe subunități sunt unice pentru enzima mitocondrială (vezi Tabelul Nomenclaturii Subunitățiipentru detalii).Cu toate acestea, „nucleul” translocant catalitic și proton al enzimei este încă foarte omologic cu cel al Atpsintazei bacteriene și cloroplaste. Topologia generală a enzimei este, de asemenea, destul de similară.

reacția catalizată

ATP sintaza catalizează sinteza ATP / hidroliza cuplată la protonul transmembranar transfer.In caz de sinteză aportul de energie provine din fluxul protonic prin coborârea diferenței de potențial protonic transmembranar electrochimic ().În cazul hidrolizei, enzima funcționează ca o pompă de protoni acționată de ATP și generează .
ecuația reacției catalizate este

ADP3- + Pi2- + NH+P <> ATP4- + H2O+ (n-1)H+N ( pH > 7.2 )

indicii „p” și „n” denotă laturile încărcate pozitiv și negativ ale membranei de cuplare.
valoarea pH-ului este importanta: valoarea pK pentru Pi2 – + H + <> Pi – este de 7,2, în timp ce valorile pK corespunzătoare pentru fosfat în ADP și ATP sunt apropiate de 6,9.
aceasta înseamnă că în intervalul pH de 6,9-7,2 reacția predominantă nu va include captarea protonilor:

ADP3- + Pi- + nH+P <> ATP4- + H2O+ nh+n ( ph 6,9-7,2 )

cu toate acestea, sub pH = 6,9, reacția predominantă este din nou ÎNSOȚITĂPRIN Protontrapping:

ADP2- + Pi- + nH+P <> ATP3- + H2O+ (n-1)H+N ( pH < 6.9 )

Thermodynamics of the ATP synthesis/hydrolysis

Traditionally the thermodynamics of ATP synthesis/hydrolysis isdescribed for the hydrolysis reaction:

ATP4- + H2O <> ADP3- + Pi2- + H+ ( pH > 7.2 )

„Physical Chemistry”(P.W.Atkins, ediția a 2-A) oferă o valoare de -30 kJ mol-1 (-7,16 kcal/mol) la 37oCas o schimbare standard „biologică” a energiei Gibbsfree (o) pentru această reacție. Aceasta este o estimare rezonabilă, pentru cifrele de la -28 la -36 kJmol-1poate fi găsită în literatură, cea mai populară fiind -30,6 kJ mol-1(-7,3 kcal/mol).schimbarea standard a energiei Gibbsfree,o, este cantitatea totală de energie care este consumată sau eliberată în timpul unei reacții chimice în condiții standard atunci când activitățile chimice ale tuturor reactanților sunt egale cu 1. În cazul reacțiilor în soluții apoase, activitățile sunt de obicei substituite de concentrații (adică 1 M); activitatea apei în sine este luată ca 1. „Biologic” standard Gibbsschimbarea energiei libere, o, este similarăparametru, dar este definit la pH 7, adică concentrația de H + nu este de 1 m, ci 10-7m. este mai practic și mai convenabil,pentru că majoritatea reacțiilor biologice au loc la pH fiziologic.
un punct foarte important, și uneori ignorat, este căo nu este cantitatea de energie disponibilăpentru a conduce alte reacții endotermice în celulă, deoarece condițiile din celulă nu sunt standard(vezi definiția de mai sus). Schimbarea reală a energiei Gibbs este
o’+ 2.3 RT log,
unde CADP,CPi, CH+și CATP sunt concentrațiile reale ale reactanților corespunzători,R este constanta gazului molar(8.314 J mol-1k-1) și T este temperatura în Kelvins. Pentru a clarifica acest punct, să luăm în considerare următorul exemplu cuvalorile arbitrare care sunt apropiate de concentrațiile intracelulare reale:

schimbarea energiei Gibbs în astfel de condiții (temperatura 310oK sau 37oC) va fi
o’+ 2.3 rt log ( cadpcpi ch+ / catp )= -30 – 19.6 = – 49.6 kJ mol-1
această cifră,calculată din concentrațiile reale ale componentelor acțiunii, reflectă energia disponibilă ca forță motrice pentru orice alt proces cuplat la hidroliza ATP în condiții date.
rezultă că același 49.6 kJ mol – 1 trebuie să fie furnizate bythe proton transport peste membrana jos electrochemicalgradient pentru a menține un astfel de mare ATP/ADP raport. Dacă presupunem că 3protonii sunt transportați pe fiecare moleculă ATP sintetizată, este necesar un gradient electrochimic atransmembranar H+ de 49,6 / 3= 16,5 kJ mol-1(adică o forță protonmotivă de 171 MV).

concluzia din exemplul de mai sus este:
energia furnizată de hidroliza ATP nu este fixă (precum și energia necesară pentru sinteza ATP). Prima aproximare depinde de concentrațiile de ADP, ATP, piși pe pH.această energie crește logaritmic la scăderea concentrației de inADP și Pi și la creșterea concentrației de ATP sau H+ (=scade liniar odată cu creșterea pH-ului). Graficele de mai jos ilustrează acest punct, arătând schimbarea la modificarea concentrației unui reactant (axa x),presupunând că concentrațiile altor reactanți sunt menținute constante la valorile utilizate în exemplul de mai sus (punctele roșii indică calculate în acest exemplu).

pentru a închide această secțiune, aș dori să menționez că, deși termodinamica sintezei ATP descrisă aici ar putea părea mai degrabăcomplex, este de fapt mult mai complex. Un punct neglijat aici a fostdiferitele stări de protonare ADP și ATP (a se vedea mai sus), cealaltă este că substraturile reale din reacțiecatalizat de ATP sintază nu sunt nucleotide pure, ci complexele lor de magneziu. Cu toate acestea, deoarece concentrația de magneziu din celula viieste relativ mare și pH-ul este de obicei peste 7.2, so the descriptiongiven is still applicable for thermodynamic estimates.

1) Nicholls, D. G. and S.J. Ferguson. Bioenergetics 2,London:Academic Press, 1992. 2) Any edition of „Physical Chemistry”by P. Atkins

Driving force for ATP synthesis catalyzed by ATP synthase.

sinteza ATP catalizată de ATP sintaza este alimentată de diferența de potențial protonic electrochimic transmembranar, compusă din două componente: cea chimică și cea electrică. Cu cât sunt mai mulți protoni pe o parte a unei membrane relativetothealtele, cu atât este mai mare forța motrice pentru ca un proton să traversezemembrană. Deoarece protonul este o particulă încărcată, mișcarea sa este, de asemenea, influențată de câmpul electric: diferența de potențial electric transmembranar va conduce protonii de la partea încărcată pozitiv la cea încărcată negativ.

o moară de apă este o analogie bună: diferența dintre nivelurile apei înainte și după baraj oferă energie potențială; fluxul de apă în jos rotează roata; rotația este utilizată pentru a efectua unele lucrări (sinteza ATP ourcase).

cantitativ este măsurată în jouli per mol (J mol-1) și este definită ca:

= -F + 2.3 RT (pHP – pHN),

unde „P” și „n” indicii indică laturile încărcate pozitiv și negativ ale membranei de cuplare; F este constanta Faraday(96 485 c mol-1); R este constanta gazului Molar(8.314 j mol-1K-1),T este temperatura în Kelvins și este diferența de potențial electric transmembranar involte. Valoareaspune, câtă energie este necesară (sau este eliberată, în funcție dedirecția fluxului de protoni transmembranari) pentru a muta 1 mol de protoni peste membrană.
este adesea mai convenabil să nu folosiți , ci forța protonmotivă (pmf):

pmf = – /F = -2.3RT/F (pHP – pHN)

la temperatura camerei (25oC) forța protonmotivă (inmillivolts, precum și )este:

pmf = – 59 (PHP – PHN)

în absența diferenței de pH transmembranar PMF este egal cu diferența de potențial transmembranar electric și poate fi măsurată direct prin mai multe tehnici experimentale (adică distribuția ionilor permeat,coloranți sensibili la potențial, schimbarea benzii carotenoide electrochromice etc.).Fiecare unitate de pH a gradientului de pH transmembranar corespunde la 59 mvof pmf.
pentru majoritatea membranelor biologice implicate în sinteza ATP, valoarea pmf se situează între 120 și 200mv ( între 11,6 și 19,3 kJ mol-1).

1) Nicholls, D. G. și S. J. Ferguson. Bioenergetica 2, Londra: Academic Press, 1992.2) o prelegere despre potențialul electrochimic a Prof. A. R. Crofts 3) Cramer, W. A. și D. B. Knaff. EnergyTransduction în membrane biologice: un manual de bioenergetica, Springer-VerlagNew York/Berlin/Londra

cataliză rotativă

catalitic mecanismul sintezei ATP implică cel mai probabil rotația subunității Gamma împreună cu Subunitateapsilon și C-Subunitoligomer în raport cu restul enzimei. O astfel de rotație a fost demonstrată experimental pentru hidroliza ATP decuplată la protontranslocare. Mai mult, experimentele recente au arătat că, dacă Gammasubunitul este forțat mecanic în rotație, are loc sinteza ATP chiar și fără translocarea protonului FO-porțiune.
pare cel mai probabil ca o astfel de rotație să aibă loc in vivo. Cu toate acestea, nu există dovezi experimentale directe pentru un astfel de mecanism rotativ în intactenzimă în condiții fiziologice.
mecanismul propus este următorul:

1. condus de protonmotiveforce, protonii sunt transferați prin porțiunea FO a enzimei. Acest transfer conduce rotația inelului c-subunitoligomer în raport cu subunitățile a și b (vezi AICI pentru detalii).
2. rotația este transmisă subunităților Gamma și Epsilon care sunt legate de inelul c-subunitoligomer. Rotația subunității Gamma asimetrice mecanicprovoacă modificări conformaționale în alfa 3 Beta 3-hexamer. Fiecare 120 de grade de rotație a subunității Gammaforțează unul din cele 3 situsuri catalitice situate la interfața alfa-Beta într-o conformație anopenată. Molecula ATP proaspăt sintetizată este eliberată șifosfatul și ADP sunt legate în schimb. Afinitatea ridicată a sitetofosfatului deschis afectează rebindarea ATP și favorizează legarea ADP.
3. rotația merge mai departe, subunitatea Gamma transformă încă 120 de gradeforțând următorul sit în conformația deschisă, iar ADP șifosfatul legat de site-ul anterior deschis este ocluzat și are loc Atpsinteza. Molecula ATP formată este eliberată cândsubunitatea Gamma face o întoarcere de 360 de grade și deschide din nou site-ul.

1) W. Junge, H. Lill, andS. Engelbrecht. (1997) ATP synthase:anelectrochemical transducer with rotatory mechanics. Trends Biochem.Sci. 22(11):420-423, . 2) H. Wang and G. Oster. (1998) Energytransduction in the F1 motor of ATP synthase. Nature 396 (6708):279-282. 3) Weber, J., and Senior, A. E. (2003) ATPsynthesis driven by proton transport in F1FO-ATPsynthase. FEBS Lett. 545(1): 61-70. 4) filme frumoase la http://nature.berkeley.edu/~hongwang/Project/ATP_synthase/

inhibitori ai ATP sintazei

activitatea ATP sintazei este inhibat în mod specific de mai mulți compuși(atât organici, cât și anorganici). Majoritatea acestor inhibitori sunt foarte toxici, așa că mare grijăși măsurile de siguranță adecvate sunt esențiale atunci când lucrăm cu ei (nu este foarte surprinzător faptul căsuntem nefericiți când ATP sintaza noastră este blocată!).Majoritatea inhibitorilor sunt specifici fie pentru porțiunea fo-translocatoare de protoni, fie pentru porțiunea hidrofilă F1, astfel încât secțiunea de mai jos este împărțită în consecință.

inhibitori ai FO

Oligomicină

Oligomicină a

Oligomicina este inhibitorul care a dat numele „FO” porțiunii încorporate în membrană a ATP sintazei. Litera subscript” O ” în FO(nu zero!) provine din sensibilitatea la Oligomicină a acestui hidrofobfosforilare Factor în mitocondrii.
Oligomicina se leagă peinterfața subunității a și a oligomerului inelului C și blochează translocarea protonului rotativ în FO. Dacă enzima este bine cuplată, activitatea F1este, de asemenea, blocată. Din cauza acestui din urmă fenomen, a subunitate de mitocondrial F1-porțiecare conectează F1 cu FO a fost numit Oligomicină-sensibilitate conferind proteine (OSCP).Această subunitate este esențială pentru o bună cuplare între F1 și FO și face ca activitatea ATPazei F1 să fie sensibilă la oligomicina inhibitorului FO, de unde și numele.
Oligomicina este specifică pentru ATP sintaza mitocondrială și în concentrații micromolare blochează eficient transportul protonilor prin FO. Acest inhibitor funcționează și în unele enzime bacteriene care prezintă o similaritate ridicată cu ATP sintaza mitocondrială, de exemplu enzima din bacteria purpurie Rhodobacter capsulatus. Dar ATP sintaza din cloroplaste și din majoritatea bacteriilor (inclusiv Escherichia coli)are o sensibilitate scăzută la oligomicină.
De asemenea, trebuie remarcat faptul că oligomicina în concentrații mari afectează, de asemenea, activitatea mitocondrială F1.

DCCD

DCCD

DCCD (abbreviation for Dicyclohexylcarbodiimide; also known as DCC, as N,N’-dicyclohexylcarbodiimide, as Bis(cyclohexyl)carbodiimide, and as 1,3-dicyclohexylcarbodiimide) is a small organic molecule thatcan covalently modify protonated carboxyl groups. Când este adăugat la ATP sintază la pH peste 8, DCCD reacționează aproape exclusiv cu gruparea carboxil a reziduului de aminoacizi acid conservat al subunității c (de aceea subunitatea c este uneori numită „proteină care leagă DCCD”). acest lucru a crescut pK și, prin urmare, poate fi protonat la un pH atât de ridicat. modificarea grupării carboxil într-o singură subunitate c este suficientă pentru a face ca întregul oligomer al inelului C să fie inactiv. Deoarece DCCD se leagă covalent de subunitatea c, această inhibare este ireversibilă.
gruparea carboxil a reziduului de aminoacizi conservat în subunitatea c-subunitatea este prezentă în toate SINTAZELE ATP cunoscute până în prezent. Deci DCCD este un inhibitor universal care poate funcționa în enzimele bacteriene, mitocondriale și cloroplaste. Mai mult, Atpazele care transportă protoni de tip V și A sunt, de asemenea, sensibile la DCCD din același motiv. Sintazele ATP care transportă sodiu sunt, de asemenea, inhibate în mod eficient de DCCD.
la pH mai mic (1 și îl inactivează. Deci, acest compus poatesă fie considerat un inhibitor atât al FO, cât și al F1. Cu toate acestea, inhibarea FOis foarte specifice, bine definite, și necesită o concentrație mult mai mică DCCD astfel încât, de obicei, thisinhibitor este utilizat ca FO-specifice.