recunoașterea moleculară prin potrivire indusă: cât de potrivit este conceptul?

practic toate fenomenele biologice depind într-un fel sau altul de recunoașterea moleculară specifică. La sfârșitul secolului al 19-lea, Emil Fischer a inventat faimoasa sa analogie de blocare și cheie pentru a imagina specificitatea reacțiilor enzimatice, care sunt o premisă moleculară a vieții (4). Enzima a fost considerată a fi un șablon rigid în care substratul trebuia să se potrivească ca cheie într-o încuietoare. Cu toate acestea, de-a lungul anilor, a devenit evident că o potrivire rigidă între structurile moleculare preformate nu poate explica toate aspectele catalizei enzimatice. De exemplu, de ce un substrat mai mic nu ar trebui să se încadreze în locul activ al unei enzime concepute pentru un substrat mai mare? Sau de ce unele enzime sunt foarte selective, dar altele pot găzdui mai multe molecule de substrat diferite din punct de vedere structural?

în acest context, în urmă cu peste 40 de ani, Daniel Koshland a formulat conceptul de potrivire indusă (7). Pentru a facilita reacția enzimatică în absența unei potriviri precise, el a postulat că „substratul poate provoca o schimbare apreciabilă în relația tridimensională a aminoacizilor la locul activ” (7). Ideea unei potriviri precise a fost reținută din imaginea de blocare și cheie, dar s-a afirmat în mod explicit că potrivirea „apare numai după modificările induse de substratul însuși” (accent original). Conceptul a devenit în curând cunoștințe de manual și de atunci a fost folosit pentru a explica tot felul de procese de recunoaștere moleculară mult dincolo de reacțiile enzimă-substrat. Într-adevăr, analiza structurală a biomoleculelor care interacționează a stabilit din nou și din nou că un complex și moleculele sale componente libere pot diferi în detalii fine ale structurii, în sprijinul aparent al recunoașterii prin potrivire indusă. Un caz bun în acest sens este oferit de mai multe complexe antigen-anticorp pentru care adaptarea spațială a fost demonstrată prin analiza structurii cristaline de înaltă rezoluție (2). Plasticitatea structurală este evidentă și în alte interacțiuni proteină-proteină (12).

de ce ar trebui să punem la îndoială un concept onorat în timp? Motivul meu este că paragonul indus de potrivire este adesea prea pregătit pentru a explica de ce interacționează moleculele fără complementaritate structurală aparentă. Problema constă în presupunerea inițială că o potrivire favorabilă se dezvoltă numai după legarea inițială, care este adesea luată prea literal. Având în vedere cinetica și termodinamica unei reacții de legare, potrivirea indusă este posibilă numai dacă potrivirea dintre siturile care interacționează este suficient de puternică pentru a oferi forța și longevitatea inițială suficient de complexe, astfel încât potrivirea indusă să aibă loc într-un timp rezonabil. Doresc să ilustrez acest punct crucial printr-un simplu model de calcul bazat pe ciclul termodinamic prezentat în Fig. 1. Luați în considerare moleculele a și B, care pot fi enzime și substrat, antigen și anticorp, hormon și receptor sau orice altă pereche de molecule care interacționează. Din motive de simplitate, presupun, de asemenea, că potrivirea indusă apare numai în molecula B, care este schimbată în B* pentru a forma complexul stabil AB*. (Această presupunere nu afectează rezultatul calculului, ci simplifică formalismul matematic.) Legarea prin potrivire indusă este descrisă prin reacțiile 1 și 2 din Fig. 1. În reacția 1, A și B interacționează pentru a forma complexul inițial AB, care este o pereche de molecule slab legate. Interacțiuni precise și favorabile energetic se formează ulterior în reacția 2, în care B este forțat în conformație B* prin potrivire indusă. Energia pentru „tragerea” și „împingerea” lui B în conformația de montare provine din potrivirea optimizată realizată în complexul final AB*. Constanta totală de legare pentru complexul AB * este K = K1, K2 = K1, K2/k–1, K–2 (vezi Fig. 1 Pentru definițiile constantelor de legare și a constantelor ratei cinetice).

ca exemplu practic, imaginați-vă un complex antigen–anticorp pentru care K este de obicei de ordinul 108 m-1. Deoarece reacția 1 este nefavorabilă, iau K1 pentru a fi 1 M–1, din care rezultă că K2 = 108 m–1. Deoarece K2 >> K1, echilibrul este bine pe partea complexului antigen-anticorp AB*. De exemplu, dacă 1 anticorp 10-6 m de la 1 la 10-6 m reacționează cu antigenul 1 la 10-6 m, echilibrul termodinamic este de 91% pe partea complexului antigen-anticorp (calculat din K = 108 m–1 și total = total = 1 la 10-6 m, unde parantezele pătrate indică concentrația). Întrebarea importantă, care este adesea trecută cu vederea, este cât timp va dura pentru a atinge această concentrație de echilibru. Cursul de timp este descris de

1

2

pentru a calcula timpul pentru a ajunge la echilibru, este nevoie de estimări rezonabile ale k1 și k2 (k–1 și k–2 rezultă din valorile alese ale K1 și K2; vezi Fig. 1). Rata de formare a unui complex foarte slab poate fi oriunde între 102 și 106 m–1•s–1. Aleg k1 = 104 M–1•s–1; cu toate acestea, valoarea lui k1 nu are prea mult efect asupra rezultatului calculului. Modificările conformaționale ale proteinelor au jumătate de milisecunde, așa că aleg k2 = 102 s–1 (jumătate de timp = 7 ms, din ln2/k2). Valorile corespunzătoare ale reacțiilor din spate sunt apoi k–1 = 104 s–1 și k–2 = 10-6 s-1. Integrarea numerică a ecuațiilor 1 și 2 pentru constantele de viteză de mai sus și 1% 10-6 M concentrațiile inițiale ale antigenului și anticorpului oferă o jumătate de timp pentru formarea complexului antigen-anticorp de ~2,5 h. atingerea echilibrului durează ~1 zi (~10 jumătate de ori). Motivul pentru acest timp de reacție lung este că, odată format, complexul instabil antigen-anticorp AB are doar o șansă foarte mică de a suferi tranziția de potrivire indusă la complexul stabil antigen-anticorp AB*. Potrivirea indusă, deși rezonabilă termodinamic, este prea lentă pentru a fi semnificativă ca reacție biologică.

selecția conformațională este o alternativă la potrivirea indusă

alți cercetători, inclusiv eu (1, 3, 5, 8, 13, 14) au subliniat că există un mecanism alternativ la potrivirea indusă. Esența selecției conformaționale, descrisă de reacțiile 3 și 4 din Fig. 1, este că schimbarea conformației nu se presupune că are loc după legarea inițială. Aceasta este o presupunere destul de evidentă. Luați complexul antigen-anticorp AB*. Se disociază în anticorp liber A și antigen liber B * prin reacția 4. Prin urmare, B* apare izolat, chiar dacă poate fi doar o conformație minoritară de scurtă durată, echilibrându-se rapid cu conformația majoră B prin reacția 3. Pentru a calcula cât durează atingerea concentrației de echilibru a AB * prin selecție conformațională, presupun că una din o mie de molecule este în conformație B* (K3 = 10-3). Rezultă că K4 = 1011 M-1 de la ciclul termodinamic al Fig. 1 trebuie să fie satisfăcută în conformitate cu K1, K2 = K3, K4 = K = 108 m–1. Presupun în continuare că modificarea conformațională B B* este la fel de rapidă ca și potrivirea indusă (k2 = k3 = 100 S–1). Mai mult, este nevoie de o valoare a ratei de asociere a lui B * cu A în reacția 4. Constantele vitezei măsurate pentru legarea antigen-anticorp se situează în intervalul 104-107 M•1 * s–1 (8, 9, 11). Aleg o valoare medie de k4 = 106 M–1•s–1. În aceste condiții, formarea complexului antigen-anticorp AB* prin reacțiile 3 și 4 are o jumătate de timp de numai 80 s; concentrația de echilibru a AB* se realizează în <15 min.

aceste calcule demonstrează că legarea prin potrivire indusă are sens numai dacă există o anumită măsură de complementaritate preexistentă între speciile care interacționează; în caz contrar, complexul inițial AB este prea scurt (o presupunere implicită în lucrarea inițială a lui Koshland). Folosind constantele de viteză înainte de mai sus k1 și k2 și 1 concentrații inițiale de 10-6 m, se constată că K1 trebuie să fie ~104 m–1 pentru a atinge aceeași jumătate de timp de 80 s pentru calea de potrivire indusă ca și pentru calea de selecție conformațională.

demonstrație experimentală a legării prin selecție conformațională

surprinzător de puține studii au încercat să arate selecția conformațională, în ciuda faptului că este mai ușor de demonstrat decât potrivirea indusă(1, 5, 8, 15). Pentru a demonstra potrivirea indusă, ar trebui să eșantionăm informații structurale pe parcursul reacției de legare, o sarcină destul de dificilă. Pentru a demonstra selecția conformațională, trebuie arătat că rata de formare a complexului AB* este liniar proporțională cu concentrația conformatorului de montare B* și neliniar proporțională cu concentrația totală de B + B*. Dacă se poate măsura reacția de echilibru conformațional 3 în absența partenerului de legare a, se poate calcula concentrația lui B* și se poate prezice viteza totală de formare a AB*.

un exemplu bine studiat este reacția fragmentului de anticorp cu un singur lanț îndreptat împotriva peptidei care conține prolină lungă de 33 de reziduuri GCN4-7p14p, numită peptidă P pe scurt (6). Peptida este foarte asemănătoare în secvență cu domeniul fermoar leucină al activatorului transcripțional de drojdie GCN4, cu excepția faptului că nu formează un fermoar leucină deoarece conține două reziduuri de prolină. (Prolinele nu sunt compatibile cu conformația elicoidală a unui fermoar de leucină, care este un dimer de helice înfășurate unul în jurul celuilalt.) Cu toate acestea, anticorpul reacționează încrucișat cu fermoarul leucină GCN4, iar această reacție încrucișată urmează în mod clar o cale de selecție conformațională. Anticorpul reacționează cu peptida desfăcută, care este furnizată din fermoarul leucină pliat (reacția 3). Comparând reacția inițială a anticorpului cu peptida P cu reacția încrucișată cu fermoarul leucină GCN4, se așteaptă ca reacția încrucișată să fie mai lentă, deoarece anticorpul trebuie să selecteze o cantitate mică de peptidă desfăcută în echilibru cu o cantitate mare de fermoar leucină pliat. Mai mult, rata reacției încrucișate cu fermoarul leucinic predominant pliat va arăta o dependență neliniară de concentrația totală a antigenului, dar o dependență liniară de concentrația cantității mici de peptidă desfășurată (8, 15). Acest lucru nu ar fi cazul unui mecanism indus-fit, care ar trebui să fie bifazic, prima fază corespunzând unei reacții de asociere bimoleculară a cărei viteză depinde liniar de concentrația totală a antigenului și a doua fază la o rearanjare conformațională independentă de concentrație. Figura 2 prezintă datele reale. Rata de formare a complexului antigen-anticorp depinde liniar de concentrația cantității mici de peptidă desfășurată și neliniar de concentrația totală a antigenului (Fig. 2A). Figura 2B prezintă urmele cinetice ale reacției mai rapide cu antigenul original și reacția mai lentă cu fermoarul leucină GCN4. Cu toate acestea, selecția conformațională a fermoarului leucinic desfăcut este încă ordine de mărime mai rapidă decât o cale indusă, deoarece legarea anticorpului la fermoarul leucinic pliat (reacția 1 din Fig. 1) este extrem de slab (1).

modelul peisajului energetic al conformației proteinelor

proteinele pliate nu au o singură structură unică, dar sunt mai bine privite ca un ansamblu mare de structuri similare cu conținut energetic similar. Acești așa-numiți conformatori sunt în fluctuație rapidă între ei (10). Dacă peisajul energetic este neted, mulți conformatori se schimbă rapid. Dacă este robust, ansamblul poate include conformatori care pot fi destul de diferiți și se pot schimba mai lent. Astfel, selecția între structurile B și B * este o vedere extrem de simplificată. În realitate, este mai mult ca o selecție între foarte multe structuri mai mult sau mai puțin potrivite (13). Cu toate acestea, rezultatul final al selecției conformaționale este același: acei conformatori care arată cea mai bună potrivire se leagă cel mai bine.

concluzii

selecția conformațională este o alternativă valoroasă la potrivirea indusă. Acest lucru nu înseamnă că legarea prin potrivire indusă nu are loc. De fapt, o combinație de selecție conformațională și potrivire indusă ar părea a fi cea mai bună descriere a interacțiunii dintre molecule care aparent nu se potrivesc optim pentru început. Putem imagina selecția între structuri parțial potrivite, urmate de reajustări minore la complexul stabil final (care, conform teoriei peisajului, este el însuși un ansamblu de conformatori similari). Ideea principală este că potrivirea indusă nu poate fi un remediu, așa cum se pretinde adesea în literatura de specialitate. Potrivirea indusă necesită o anumită potrivire moleculară anterioară pentru a oferi suficientă afinitate înainte de adaptarea conformațională. Dacă această condiție nu este îndeplinită, potrivirea indusă duce la un blocaj cinetic, chiar dacă reacția generală este fezabilă termodinamic.