Molekylær genkendelse ved induceret pasform: hvor Fit er konceptet?

næsten alle biologiske fænomener afhænger på en eller anden måde af specifik molekylær genkendelse. I slutningen af det 19.århundrede opfandt Emil Fischer sin berømte lock-and-key-analogi for at forestille sig specificiteten af reaktioner, som er en molekylær forudsætning for livet (4). Det blev anset for at være en stiv skabelon, hvor substratet skulle passe som en nøgle i en lås. I årenes løb blev det imidlertid tydeligt, at en stiv pasform mellem præformede molekylære strukturer ikke kan forklare alle aspekter af katalyse. For eksempel, hvorfor skal et mindre substrat ikke passe ind i det aktive sted for et ferment designet til et større substrat? Eller hvorfor er nogle stoffer meget selektive, men andre kan rumme flere strukturelt forskellige substratmolekyler?

det er i denne sammenhæng, at Daniel Koshland for over 40 år siden formulerede begrebet induceret pasform (7). I fravær af en præcis pasform postulerede han, at “substratet kan forårsage en mærkbar ændring i det tredimensionelle forhold mellem aminosyrerne på det aktive sted” (7). Ideen om en præcis pasform blev bevaret fra lock-and-key-billedet, men det blev udtrykkeligt anført, at pasformen “kun forekommer efter de ændringer, der er induceret af selve underlaget” (vægt original). Konceptet blev hurtigt lærebogskendskab og er siden blevet brugt til at forklare alle former for molekylære genkendelsesprocesser langt ud over reaktioner. Ja, strukturel analyse af interagerende biomolekyler har igen og igen fastslået, at et kompleks og dets frie komponentmolekyler kan variere i fine detaljer om strukturen, i tilsyneladende understøttelse af genkendelse ved induceret pasform. Et godt eksempel i punkt er tilvejebragt af flere antigen-antistofkomplekser, for hvilke rumlig tilpasning er blevet demonstreret ved højopløsnings krystalstrukturanalyse (2). Strukturel plasticitet er også tydelig i andre protein-protein interaktioner (12).

hvorfor skulle man stille spørgsmålstegn ved et tidskendt koncept? Min grund er, at den inducerede fit paragon ofte er for klar til at forklare, hvorfor molekyler uden tilsyneladende strukturel komplementaritet interagerer. Problemet ligger i den oprindelige antagelse om, at en gunstig pasform kun udvikler sig efter indledende binding, som ofte tages for bogstaveligt. I betragtning af kinetikken og termodynamikken i en bindingsreaktion er induceret pasform kun mulig, hvis kampen mellem de interagerende steder er stærk nok til at tilvejebringe den indledende komplekse nok styrke og levetid, så induceret pasform finder sted inden for en rimelig tid. Jeg ønsker at illustrere dette afgørende punkt ved en simpel modelberegning baseret på den termodynamiske cyklus vist i Fig. 1. Molekylerne A og B, som kan være substrat, antigen og antistof, hormon og receptor eller ethvert andet par af interagerende molekyler. For enkelhedens skyld antager jeg også, at den inducerede pasform kun forekommer i molekyle B, som ændres til B* for at danne det stabile kompleks AB*. (Denne antagelse påvirker ikke resultatet af beregningen, men forenkler den matematiske formalisme.) Binding ved induceret pasform er beskrevet ved reaktionerne 1 og 2 i Fig. 1. I reaktion 1 interagerer A og B for at danne det oprindelige kompleks AB, som er et løst bundet par molekyler. Præcise og energisk gunstige interaktioner dannes bagefter i reaktion 2, Hvor B tvinges til konformation B* ved induceret pasform. Energien til at” trække “og” skubbe ” af B ind i tilpasningskonformationen stammer fra den optimerede pasform, der opnås i det endelige kompleks AB*. Den samlede bindingskonstant for kompleks AB* er K = K1 liter K2 = k1 liter k2 / k–1 liter k–2 (Se Fig. 1 for definitioner af bindingskonstanter og kinetiske hastighedskonstanter).

som et praktisk eksempel kan du forestille dig et antigen-antistofkompleks, for hvilket K typisk er af størrelsesordenen 108 M–1. Da reaktion 1 er ugunstig, tager jeg K1 til at være 1 M–1, hvorfra det følger, At K2 = 108 M–1. Fordi K2 >> K1, er ligevægten godt på siden af antigen-antistofkomplekset AB*. For eksempel, hvis 1 liter 10-6 M antistof reagerer med 1 liter 10-6 M antigen, er den termodynamiske ligevægt 91% på siden af antigen-antistofkomplekset (beregnet ud fra K = 108 M–1 og total = total = 1 liter 10-6 M, hvor firkantede parenteser indikerer koncentration). Det vigtige spørgsmål, som ofte overses, er, hvor lang tid det vil tage at nå denne ligevægtskoncentration. Tidsforløbet er beskrevet af

1

2

for at beregne tiden for at nå ligevægt har man brug for rimelige skøn over k1 og k2 (k–1 og k–2 følger fra de valgte værdier af K1 og K2; se Fig. 1). Dannelseshastigheden for et meget svagt kompleks kan være hvor som helst mellem 102 og 106 M–1•s–1. Jeg vælger k1 = 104 M–1•s–1; værdien af k1 har dog ikke stor effekt på resultatet af beregningen. Konformationsændringer i proteiner har halv gange millisekunder, så jeg vælger k2 = 102 s–1 (halvtid = 7 ms, fra ln2/k2). De tilsvarende værdier for rygreaktionerne er derefter k–1 = 104 s–1 og k–2 = 10-6 s-1. Numerisk integration af ligninger 1 og 2 for de ovennævnte hastighedskonstanter og 1 liter 10-6 M startkoncentrationer af antigen og antistof giver en halvtid for dannelsen af antigen-antistofkomplekset på ~2,5 h. således når ligevægt tager ~1 dag (~10 halv gange). Årsagen til denne lange reaktionstid er, at det ustabile antigen-antistofkompleks AB, når det først er dannet, kun har en meget lille chance for at gennemgå den inducerede fitovergang til det stabile antigen-antistofkompleks AB*. Selvom den inducerede pasform er termodynamisk rimelig, er den for langsom til at være meningsfuld som en biologisk reaktion.

Konformationsvalg er et alternativ til induceret pasform

andre forskere, herunder mig selv (1, 3, 5, 8, 13, 14) har påpeget, at der er en alternativ mekanisme til induceret pasform. Essensen af konformationsvalg, beskrevet ved reaktionerne 3 og 4 i Fig. 1, er, at konformationsændringen ikke antages at forekomme efter indledende binding. Dette er en ret åbenbar antagelse. Tag antigen-antistofkomplekset AB*. Det dissocieres til frit antistof A og frit antigen B* gennem reaktion 4. Derfor forekommer B* isoleret, selvom det kun kan være en kortvarig mindretalskonformation, der hurtigt svarer til den største konformation B gennem reaktion 3. For at beregne, hvor lang tid det tager at nå ligevægtskoncentrationen af AB* ved konformationsvalg, antager jeg, at en ud af tusind molekyler er i konformation B* (K3 = 10-3). Det følger heraf, at K4 = 1011 M–1 Siden den termodynamiske cyklus i Fig. 1 skal opfyldes i henhold til K1 liter K2 = K3 liter K4 = K = 108 M–1. Jeg antager endvidere, at konformationsændringen B Kurt B* er lige så hurtig som den inducerede pasform (k2 = k3 = 100 s–1). Desuden har man brug for en værdi af associeringshastigheden for B* med A i reaktion 4. Målte hastighedskonstanter for antigen-antistofbinding ligger i området 104-107 M–1 * s–1 (8, 9, 11). Jeg vælger en mellemværdi på k4 = 106 M–1•s–1. Under disse betingelser har dannelsen af antigen-antistofkomplekset AB * gennem reaktioner 3 og 4 en halvtid på kun 80 s; ligevægtskoncentrationen af AB* opnås i <15 min.

disse beregninger viser, at binding ved induceret pasform kun giver mening, hvis der er en vis grad af allerede eksisterende komplementaritet mellem de interagerende arter; ellers er det oprindelige kompleks AB for kortlivet (en antagelse implicit i Koshlands oprindelige papir). Ved at anvende de ovennævnte fremadgående hastighedskonstanter k1 og k2 og 1 liter 10-6 M indledende koncentrationer finder man, at K1 skal være ~104 M–1 for at opnå den samme halvtid på 80 s for den inducerede fitvej som for den konformationsvalgsvej.

eksperimentel demonstration af binding ved konformationsvalg

overraskende få undersøgelser har forsøgt at vise konformationsvalg på trods af at det lettere demonstreres end induceret pasform (1, 5, 8, 15). For at demonstrere induceret pasform skulle man prøve strukturelle oplysninger i løbet af bindingsreaktionen, en temmelig vanskelig opgave. For at demonstrere konformationsvalg skal man vise, at dannelseshastigheden af komplekset AB* er lineært proportional med koncentrationen af den passende konforme B* og ikke-lineær proportional med den samlede koncentration af B + B*. Hvis man kan måle konformationsligevægtsreaktionen 3 i fravær af bindingspartneren A, kan man beregne koncentrationen af B* og forudsige den samlede dannelseshastighed for AB*.

et godt undersøgt eksempel er reaktionen af det enkeltkædede antistoffragment rettet mod det 33-restlange prolinholdige peptid GCN4-7p14p, kaldet peptid P for kort (6). Peptidet er meget ens i rækkefølge til leucin lynlåsdomænet i gærtranskriptionsaktivatoren GCN4, bortset fra at det ikke danner en leucin lynlås, fordi den indeholder to prolinrester. (Proliner er ikke kompatible med den spiralformede konformation af en leucin lynlås, som er en dimer af spiraler viklet rundt om hinanden.) Antistoffet krydsreagerer imidlertid med gcn4 leucin lynlås, og denne krydsreaktion følger tydeligt en konformationsvalgsvej. Antistoffet reagerer med det udfoldede peptid, som tilføres fra den foldede leucin lynlås (reaktion 3). Sammenligning af den oprindelige reaktion af antistoffet med peptid P til krydsreaktionen med leucin lynlås GCN4, man forventer, at krydsreaktionen er langsommere, da antistoffet skal vælge en lille mængde udfoldet peptid i ligevægt med en stor mængde foldet leucin lynlås. Endvidere vil hastigheden af krydsreaktionen med den overvejende foldede leucin lynlås vise en ikke-lineær afhængighed af den totale antigenkoncentration, men alligevel en lineær afhængighed af koncentrationen af den lille mængde udfoldet peptid (8, 15). Dette ville ikke være tilfældet for en induceret fit-mekanisme, som skal være bifasisk, med den første fase svarende til en bimolekylær associeringsreaktion, hvis hastighed afhænger lineært af den samlede antigenkoncentration og den anden fase til en koncentrationsuafhængig konformationsomlægning. Figur 2 viser de faktiske data. Hastigheden for dannelse af antigen-antistofkomplekset afhænger lineært af koncentrationen af den lille mængde udfoldet peptid og ikke-lineært på den totale antigenkoncentration (Fig. 2A). Figur 2b viser de kinetiske spor af den hurtigere reaktion med det originale antigen og den langsommere reaktion med gcn4 leucin lynlås. Ikke desto mindre er konformationsvalg af den udfoldede leucin-lynlås stadig størrelsesordener hurtigere end en induceret pasform, fordi binding af antistoffet til den foldede leucin-lynlås (reaktion 1 i Fig. 1) er ekstremt svag (1).

energilandskabsmodellen for proteinkonformation

foldede proteiner har ikke en enkelt unik struktur, men betragtes bedre som et stort ensemble af lignende strukturer med lignende energiindhold. Disse såkaldte konformere er i hurtige udsving med hinanden (10). Hvis energilandskabet er glat, udveksles de mange konformere hurtigt. Hvis det er robust, kan ensemblet omfatte konformere, der kan være helt forskellige og udveksle langsommere. Valget mellem strukturerne B og B* er således et groft oversimplificeret billede. I virkeligheden er det mere som et udvalg blandt mange flere eller mindre passende strukturer (13). Slutresultatet af konformationsvalg er dog det samme: de konformere, der viser den bedste pasform, binder bedst.

konklusioner

Konformationsvalg er et værdifuldt alternativ til induceret pasform. Dette betyder ikke, at binding ved induceret pasform ikke forekommer. Faktisk synes en kombination af konformationsvalg og induceret pasform at være den bedste beskrivelse af interaktionen mellem molekyler, der tilsyneladende ikke passer optimalt til at begynde med. Vi kan forestille os valg mellem delvist passende strukturer efterfulgt af mindre justeringer til det endelige stabile kompleks (som ifølge landskabsteorien i sig selv er et ensemble af lignende konformere). Hovedpunktet er, at induceret pasform ikke kan være en kur-alt, som det ofte påstås i litteraturen. Induceret pasform kræver en vis forudgående molekylær match for at tilvejebringe tilstrækkelig affinitet inden konformationel tilpasning. Hvis denne betingelse ikke er opfyldt, fører induceret pasform til en kinetisk flaskehals, selvom den samlede reaktion er termodynamisk gennemførlig.