Die Industrialisierung ist mit erhöhten Raten des horizontalen Gentransfers im menschlichen Mikrobiom verbunden

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Darmbakterien, die in Symbiose mit Menschen leben, haben im Laufe der Evolution hohe Raten des horizontalen Gentransfers (HGT) erfahren, zumindest bei Individuen in Industrieländern 1,2. Es bleibt jedoch unklar, wie die HGT-Raten mit der typischen bakteriellen Verweilzeit im menschlichen Darm verglichen werden und wie der Lebensstil des menschlichen Wirts die HGT-Rate und die Art der übertragenen Gene beeinflussen könnte.

Wenn die Zeitskala des Transfers langsamer ist als die Verweilzeit innerhalb des Wirts, erwerben einzelne Mikrobiome in erster Linie neue Funktionen durch den Erwerb neuer Stämme. Wenn die Übertragungsrate jedoch ausreichend schnell ist, könnte sich ein Mikrobiom, das in Bezug auf die Bakterienpopulationen 3-5 ’stabil‘ ist, dennoch als Reaktion auf wirtsspezifische Umweltstörungen durch HGT entwickeln, möglicherweise als Reaktion auf Ernährung oder Änderungen in kulturellen Praktiken.Spezifische Beispiele zeigen, dass HGT innerhalb eines einzelnen Individuums 6-10 auftreten kann, insbesondere wenn es eine starke Selektion für Zielfunktionen wie Antibiotikaresistenz 11-13 gibt. Aber welcher Bruchteil der Arten im menschlichen Mikrobiom hat Gene von einer anderen Spezies in ihrem jüngsten menschlichen Wirt erworben, und wie vergleicht sich die Zeitskala der HGT mit der Zeitskala der menschlichen Besiedlung? In unserer vorherigen Studie 1 konzentrierten wir uns auf HGTs mit Sequenzen mit einer Ähnlichkeit von mehr als 99% und einer Länge von mehr als 500 bp. Unter der Annahme einer typischen molekularen Uhr von ~ 1 SNP / Genom / Jahr 14 und einer Genomgröße von 106 bp stimmen diese Kriterien mit Transferereignissen überein, die vor 0 bis 10.000 Jahren stattfanden. Um die Frage zu beantworten, ob kommensale Stämme routinemäßig neue Funktionen durch HGT erwerben, sind genauere Schätzungen der Zeitskala für HGT erforderlich.

Um die Rate der HGT auf kürzeren Zeitskalen zu messen, verglichen wir die Menge des Transfers, die zwischen Bakterien beobachtet wurde, die aus demselben Individuum isoliert wurden, mit der, die zwischen Bakterien von verschiedenen Individuen beobachtet wurde. Wir stellten die Hypothese auf, dass wir, wenn die Übertragungsrate im Vergleich zur typischen Verweilzeit einer Bakterienlinie, die den menschlichen Körper besiedelt, schnell wäre, höhere Übertragungsraten zwischen Stämmen beobachten würden, die vom selben Wirt isoliert wurden. Alternativ, wenn die Zeitskala für den Transfer ausreichend länger war als eine menschliche Lebensdauer, dann würden wir ähnliche Niveaus zwischen Bakterien beobachten, unabhängig davon, ob sie vom selben Wirt isoliert wurden. Um unsere Analyse auf die jüngsten Ereignisse zu konzentrieren, suchten wir nach großen Blöcken (>10kb) von 100% identischer DNA, die HGT-Ereignissen entsprechen, die vor 0 und ~ 100 Jahren aufgetreten sind, obwohl wir unsere Ergebnisse auch mit kürzeren mobilen Elementen mit einer Länge von mehr als 500bp bestätigen. In dieser Studie konzentrieren wir uns nur auf Transfers zwischen Bakterienspezies, wobei Genrekombinationsereignisse innerhalb der Spezies ignoriert werden.Die existierenden Referenz-Isolat-Genome 4,15-19 können nicht verwendet werden, um den direkten Gentransfer zwischen zwei Bakterien innerhalb von Menschen zu testen, da fast alle diese Stämme von verschiedenen Individuen isoliert wurden. Darüber hinaus wurden diese Referenzsammlungen fast ausschließlich aus industrialisierten Bevölkerungsgruppen entnommen und spiegeln nicht die Vielfalt menschlicher Lebensstile wider. Daher analysierten wir das gesamte Genom von 6.188 neu kultivierten Bakterienisolaten unter Verwendung von Stuhlproben, die von 34 Individuen in 9 menschlichen Populationen weltweit gesammelt wurden: die Hadza- und Datoga-Populationen in Tansania, Beti- und Baka-Populationen in Kamerun, Inuit-Individuen in der kanadischen Arktis, Sami- und finnische Individuen in Finnland sowie Individuen eines Northern Plains-Stammes in Montana und aus der Gegend von Boston in den USA; Ergänzende Abbildung 1 & Ergänzende Tabelle 1 für eine Beschreibung des Lebensstils). Wir gruppierten bakterielle Genome in Artencluster basierend auf genomischer Ähnlichkeit (unter Verwendung des Genabstands als Proxy für die durchschnittliche Nukleotididentität, siehe Methoden). Diese Genome repräsentieren 253 Bakterienarten in 6 Phyla und gruppieren sich in 62 bekannte und 54 unbekannte Gattungen (Abbildung 1A & Ergänzende Tabellen 2 & 3 für Kultivierungsdaten und Statistiken zur Genomassemblierung). Die untersuchten menschlichen Populationen hatten unterschiedliche genetische Hintergründe und sehr unterschiedliche Lebensstile, von industrialisierten bis zu Jäger-Sammler-Gemeinschaften. Wir haben viele Bakterienisolate verschiedener Arten in jedem Individuum untersucht, und entdeckte Tausende von aktuellen HGTs in unseren genomischen Daten: insgesamt haben wir 134.958 mobile Elemente über mehrere Bakterienarten hinweg erfasst, sowohl innerhalb als auch zwischen Menschen. 57% der bakteriellen Genome (3556/6188) waren an mindestens einem kürzlichen HGT-Ereignis beteiligt (Abbildung 1A), was darauf hinweist, dass HGT im heutigen menschlichen Darm weit verbreitet ist.

Wir fanden heraus, dass Bakterienspeziespaare, die innerhalb von Personen entnommen wurden, mit größerer Wahrscheinlichkeit kürzlich übertragene DNA teilen als die gleichen Speziespaare, die von zwei verschiedenen Personen entnommen wurden (die Anzahl der beobachteten HGT-Ereignisse innerhalb von Personen wurde mit der erwarteten Anzahl von Ereignissen verglichen, basierend auf der Anzahl der Ereignisse zwischen Personen, wobei die Artenzusammensetzung und die ungleiche Probenahmentiefe korrigiert wurden, Abbildung 1B, p-Wert < 2.2 ×10-16, siehe Methoden), und dieses Signal wird von vielen verschiedenen Bakterienarten gesteuert, die verschiedene taxonomische Gruppen abdecken (Abbildung 1A & 1B). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Zeitskala für HGT kurz ist. Streng genommen können wir nicht zwischen Übertragungen unterscheiden, die im Herkunftsland stattgefunden haben, und denen, die möglicherweise beim Elternteil oder sogar beim Großelternteil eines Gastgebers stattgefunden haben. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass ein großer Teil der Übertragungen vor der Besiedlung des Wirts erfolgte, da die Gesamtrate der HGT im Vergleich zur Vererbungsrate von Stämmen von einem Elternteil groß ist (siehe Diskussion in Ergänzende Informationen). Diese Ergebnisse sind robust zu den Einzelheiten unserer Analyse: eine Zunahme der HGT-Häufigkeit innerhalb von Individuen wird repliziert, wenn Analysen auf jede unserer Stichprobenpopulationen beschränkt werden oder wenn die 5.126.962 mobilen Elemente größer als 500bp berücksichtigt werden, die auf 98% (6068/6188) unserer Genome verteilt sind (p-Wert < 2,2 ×10-16) (Abbildung 1A & Supp Abb. 2 & 3). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass HGTs auf Zeitskalen auftreten, die ausreichend kurz sind, um die Funktionen der Darmgemeinschaft während des Lebens eines Individuums umfassend und kontinuierlich umzugestalten.Da die HGT-Frequenz in erster Linie durch Übertragungen zwischen eng verwandten Organismen bestimmt wird, die dazu neigen, mehr Gene miteinander auszutauschen als entfernt verwandte Arten, haben wir die HGT-Frequenz über einen Bereich phylogenetischer Entfernungen untersucht. Wir zeigen, dass die phylogenetische Verwandtschaft insgesamt ein starker Treiber für HGTs ist (engere verwandte Arten übertragen mehr Gene, Linearer Mischeffektmodell-Fit-Test, p-Wert < 2.2 × 10-16), und dass die starke Anreicherung für den Transfer innerhalb von Individuen im Vergleich zu zwischen Individuen über alle phylogenetischen Entfernungen auftritt (Abbildung 2A), was auch unter Berücksichtigung aller HGTs größer als 500bp gilt (Ergänzende Abbildung 4).

Nachdem wir die schnelle Zeitskala der HGT ermittelt hatten, fragten wir als nächstes, welche Faktoren die Genaustauschfrequenz im menschlichen Darm antreiben. Wir stellten die Hypothese auf, dass Paare hochhäufiger Arten in einem bestimmten Ökosystem eine höhere Wahrscheinlichkeit für einen Genaustausch haben würden als Paare, an denen mindestens eine Art mit geringer Häufigkeit beteiligt ist, unabhängig von ihrer phylogenetischen Entfernung, obwohl wir zuvor gegen eine wichtige Rolle der Häufigkeit bei der Kontrolle der HGT-Frequenz argumentiert haben 1. Diese Hypothese wurde nie direkt getestet, da Datensätze, die eine eingehende genomische Probenahme mit genauen Abundanzschätzungen kombinierten, noch nicht existierten. Um die Abundanzhypothese zu testen, generierten wir metagenomische Daten für die Stuhlproben, aus denen wir bakterielle Isolate kultiviert hatten, und berechneten die durchschnittliche Häufigkeit jeder Bakterienart innerhalb jeder Person, indem wir metagenomische Daten gegen die Isolatgenome kartierten (siehe Methoden). Wir fanden heraus, dass die Artenhäufigkeit eine starke Determinante für HGT ist (Linear Mixed Effects Model Fit Test, p-Wert = 1,4 × 10-11), unabhängig von der Phylogenie (Abbildung 2B), die repliziert wird, wenn alle HGT größer als 500bp betrachtet werden (Ergänzende Abbildung 5). Reichlich vorhandene Bakterien sind eher in HGT mit anderen reichlich vorhandenen Bakterien, die im Einklang mit den kanonischen Mechanismen der HGT (z. B. Konjugation, Transformation und Transduktion 20), die Zell-zu-Zell-Kontakt oder den Zugang zu freier DNA in der Umwelt beinhalten engagieren.Da HGT durch phylogenetische Distanz und Abundanz gesteuert wird und die Abundanz bei Individuen innerhalb einer Wirtspopulation 5 ähnlich ist, stellten wir die Hypothese auf, dass dieselbe Darmbakterienspezies Gene zwischen Individuen austauschen würde. Um diese Hypothese zu testen, verglichen wir die HGT-Frequenzen für Bakterienspeziespaare, die von mindestens 4 Personen in unserer USA-Kohorte geteilt wurden. Wir fanden heraus, dass die HGT-Häufigkeit für die Mehrheit der Bakterienarten bei allen Menschen homogen ist (die beobachtete durchschnittliche Standardabweichung der HGT-Häufigkeit innerhalb einer Person bei allen Menschen wurde mit der erwarteten Verteilung unter Verwendung eines Randomisierungstests mit 1.000 Permutationen verglichen, p-Wert < 0,001, Ergänzende Abbildung 6). Dies deutet darauf hin, dass der Kernsatz von reichlich vorhandenen Linien, die von Individuen innerhalb einer bestimmten Population geteilt werden, ein Kernnetzwerk des Genaustauschs darstellt, das es bakteriellen Linien ermöglicht, sich an den gemeinsamen selektiven Druck anzupassen, der in der Wirtspopulation wirkt.Als nächstes fragten wir, ob die Architektur der Zellhüllen zu Unterschieden in der HGT-Frequenz beiträgt, unabhängig von Phylogenie und Häufigkeit. Wir verwendeten Referenz-Gram-Färbedaten für jede Bakterienart als Proxy der Zellwandarchitektur, um grampositive Monodermbakterien (einzelne Zytoplasmamembran und eine dicke Peptidoglycanschicht) von gramnegativen Didermbakterien (zwei Membranen, die eine dünne Peptidoglycanschicht umgeben) zu trennen. Wir fanden heraus, dass Diderm-Bakterien häufiger an HGTs beteiligt sind als Monoderm-Bakterien, unabhängig von Phylogenie und Häufigkeit (p-Wert = 1 × 10-3, Abbildung 2C), was auch bei Betrachtung aller HGTs größer als 500bp beobachtet wird (Ergänzende Abbildung 7). Interessanterweise war die HGT-Frequenz zwischen zwei Diderm-Bakterien der HGT-Frequenz zwischen einem Monoderm und einem Diderm-Bakterium ähnlich, was darauf hindeutet, dass Diderm-Bakterien Transfermechanismen haben, die es ihnen ermöglichen, DNA-Material mit einem viel breiteren Spektrum genetischer Hintergründe zu teilen.Der Übergang von nicht-industrialisierten zu industrialisierten Lebensstilen ist mit drastischen Veränderungen der Mikrobiomvielfalt und -zusammensetzung verbunden 21-23. Es ist jedoch wenig darüber bekannt, wie sich diese Lebensstilübergänge auf die Muster des Genaustauschs im menschlichen Darmmikrobiom auswirken.Um zu testen, ob menschliche Populationen mit einem industrialisierten Lebensstil im Vergleich zu Populationen mit einem nicht industrialisierten Lebensstil unterschiedliche HGT-Muster aufweisen, haben wir uns die Artenpaare in unserem Datensatz angesehen, die von Individuen in den USA (Region Boston) und Individuen geteilt werden, die in einer der vier Populationen leben, von denen wir die größte Stichprobe von Bakterienarten haben: die Hadza (Jäger und Sammler), die Datoga (Hirten), die Beti (Landwirte) und die Baka (die derzeit von einem Jäger-Sammler- zu einem landwirtschaftlichen Lebensstil übergehen). Für jedes Bakterienspeziespaar berechneten wir die durchschnittliche HGT-Häufigkeit auf der Ebene der menschlichen Bevölkerung und betrachteten gemeinsam genutzte identische (100%) DNA-Blöcke, die größer als 500bp sind. Überraschenderweise fanden wir heraus, dass Artenpaare, die in der US-Industriepopulation untersucht wurden, Gene häufiger austauschten als in nicht-industrialisierten Populationen (die Anzahl der beobachteten HGT-Ereignisse in nicht-industrialisierten Populationen wurde mit der erwarteten Anzahl von Ereignissen verglichen, basierend auf der Anzahl der Ereignisse in industrialisierten Populationen, wobei die Artenzusammensetzung und die ungleichmäßige Stichprobentiefe korrigiert wurden, p-Wert < 2,2 × 10-16, siehe Methoden) (Abbildung 3A). Dieser Effekt gilt, wenn die Analyse im Vergleich zu den USA auf jede nicht-industrialisierte Bevölkerung einzeln beschränkt wird (Abbildung 3B). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse zum ersten Mal, dass der Lebensstil des Wirts die Gentransferfrequenzen im menschlichen Darmmikrobiom beeinflusst. Diese Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass der Übergang zu industrialisierten Lebensstilen zu einem drastischen Anstieg der Gentransfers innerhalb des Darmmikrobioms führte, möglicherweise aufgrund erhöhter Umweltstörungen der Darmbakterienpopulationen.

Wir argumentierten, dass, wenn HGT auf sehr kurzen Zeitskalen auftritt, die Art der übertragenen Gene den einzigartigen selektiven Druck widerspiegeln sollte, der mit verschiedenen individuellen Wirten und Populationen verbunden ist 24. Unter Verwendung von Gentransfers, an denen Artenpaare beteiligt waren, die sowohl in der US-Bevölkerung als auch in den Hadza-, Beti- oder Datoga-Völkern gefunden wurden, verglichen wir zunächst breite funktionelle Kategorienprofile und stellten fest, dass sie sich über Lebensstile hinweg unterschieden (Abbildung 4A, Chi-Quadrat-Anpassungstest, p-Werte < 0.001).

Nachdem wir gezeigt hatten, dass es breite funktionelle Unterschiede zwischen den Arten von Genen gibt, die in verschiedenen Populationen übertragen werden, konzentrierten wir uns auf Gene, die an Funktionen beteiligt sind, von denen wir dachten, dass sie sich zwischen den Populationen unterscheiden können, einschließlich Genen, die an mobilen Elementen (Phagen, Plasmid, Transposon), Antibiotikaresistenz und kohlenhydratabbauenden (CAZYM-) Funktionen beteiligt sind. Wir fanden heraus, dass Darmbakterien in industrialisierten Populationen höhere relative Mengen an Plasmid-, Transposon- und Phagenelementen austauschten (Abbildung 4B, zweidimensionale Z-Tests, korrigierte p-Werte < 0.001), im Einklang mit insgesamt höheren Niveaus von HGT. Hadza- und Beti-Individuen, die große Mengen unverdaulicher Fasern konsumieren, beherbergen Darmbakterien, die CAZyme-Gene mit höheren Frequenzen austauschen als Individuen, die in den USA leben (Abbildung 4B). Sehr hohe Übertragungsfrequenzen von Antibiotikaresistenzgenen wurden auch in den Darmmikrobiomen von Datoga-Individuen gefunden. Die Datoga sind Viehzüchter, die hauptsächlich Rinder züchten und viel Fleisch und Milchprodukte von ihren Tieren konsumieren. Wie andere Hirtenbauern im Norden Tansanias verabreichen sie ihren Herden Antibiotika 25,26. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese jüngsten landwirtschaftlichen Praktiken die Fitnesslandschaft in den Eingeweiden der Datoga-Menschen schnell verändert haben und bereits die Muster des Gentransfers in ihren Mikrobiomen beeinflusst haben. Da die Verwendung kommerzieller antimikrobieller Mittel bei Hirtenpopulationen in Entwicklungsländern mittlerweile weit verbreitet ist, können ähnliche Effekte in vielen Populationen weltweit auftreten, mit breiteren Auswirkungen auf die Ausbreitung antimikrobieller Resistenzen außerhalb der Klinik.Zahlreiche Studien haben untersucht, wie Veränderungen in der Ernährung und klinische Interventionen wie fäkale Mikrobiota-Transplantationen 27,28 die Zusammensetzung des Darmmikrobioms beeinflussen. Es ist jedoch schwierig, aus kompositorischen Änderungen auf mechanistisches Verständnis zu schließen. Unsere Studie zeigt, dass HGTs innerhalb des Darmmikrobioms den einzigartigen selektiven Druck jedes menschlichen Wirts widerspiegeln. Somit, HGT-Muster können dann verwendet werden, um selektive Kräfte zu identifizieren, die in jedem Individuum wirken, und um ein mechanistischeres Verständnis dieser Ereignisse zu erhalten. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass Daten zur Sequenzierung des gesamten Genoms Informationen zur personalisierten Mikrobiomfunktion mit einer Präzision liefern, die gängige Ansätze wie 16S-Amplikon und metagenomische Sequenzierung nicht erreichen können. Schließlich ist die hohe HGT-Rate im menschlichen Darm wahrscheinlich eine neuere Entwicklung als Reaktion auf den industrialisierten Lebensstil, der weiter von drastischen Veränderungen in der Art des Austauschs von Genen begleitet wurde. Wir können die Konsequenzen dieser Verschiebungen in der HGT-Frequenz und -Funktion für die menschliche Gesundheit noch nicht vollständig einschätzen.