litiumkloridi tappaa tehokkaasti mehiläisten loisen Varroa destructorin systeemisellä vaikutustavalla

pilottitutkimus: RNAi: sta litiumkloridiin

pilottitutkimuksessa punkkien saastuttamia mehiläisiä kuljetettiin häkkiin ja ruokittiin Sakkaroosisiirapilla, joka sisälsi mahdollisesti välttämättömien Varroa-geenien dsrnoja (täydentävä taulukko s1). Tavallinen sakkaroosisiirappi (käsittelemätön) ja siirappi, jossa dsRNA perustuu vihreän fluoresoivan proteiinin GFP (dsGFP ctrl) koodaussekvenssiin, toimivat kontrolleina. GFP ilmaistaan bioluminesenssissa hydrozoan meduusa Aequorea victoria. GFP-sekvenssi valittiin kontrolliksi, koska hunajamehiläisten tai Varroa-punkin genomissa ei ole homologista geeniä. Hoitamattomassa ryhmässä punkkikuolleisuus oli <5%. Sen sijaan kaikki Varroa-geeneihin kohdistuvaa dsRNA: ta sisältävää sakkaroosiliuosta saaneiden mehiläisten punkit tapettiin tehokkaasti kolmen päivän kuluessa. Sama vaikutus punkkiin havaittiin kuitenkin kontrollikokeessa, jossa mehiläisille syötettiin GFP dsRNA (Supplementary Fig. S1). Nämä tulokset sulkivat pois ehdotetun RNAi-välitteisen mekanismin, mutta viittasivat joko RNA: n vielä tuntemattomaan vaikutukseen tai testiliuoksen muiden komponenttien aktiivisuuteen. Koska dsrnojen tuotannossa käytettiin suuria litiumkloridipitoisuuksia (licl) ja siksi niitä syötettiin mehiläisille yhdessä dsRNA: n kanssa, päätimme syöttää licl: ää sakkaroosiliuoksessa häkkimehiläisille testataksemme sen aktiivisuutta Varroa-punkkeja vastaan. Silmiinpistävää on, että 25 mM: n LiCl-pitoisuus, joka vastaa laskettua pitoisuutta dsRNA-liuoksessa, tappoi punkit yhtä tehokkaasti kuin dsRNA: ta sisältävät testiaineet. Lisäksi sen jälkeen, kun LiCl oli suurelta osin poistettu dsRNA: sta laajalla pesulla (pesty dsGFP ctrl), mietisidaalinen aktiivisuus väheni huomattavasti, kuten viivästynyt aloitus ja vähentynyt aktiivisuus osoittavat (täydentävä Kuva. S1). Näistä tiedoista päättelimme, että Licl, ei RNA knockdown, välitti havaittua aktiivisuutta Varroapunkeissa ja että LiCl: n potentiaalia varroasidina kannattaisi analysoida.

Litiumkloridin tehokas konsentraatio

tukeaksemme pilottitutkimuksemme ensisijaisia havaintoja perustimme häkkikokeita eri licl-pitoisuuksilla vankkaa tilastollista analyysia varten. Pilottitutkimuksessa tehokkaaksi todetun 25 mM: n pitoisuuden lisäksi käytimme 2 mM: n, 4 mM: n ja 10 mM: n pitoisuuksia määrittääksemme alhaisemman tehokynnyksen. Tulokset tukivat edellisen tutkimuksen tuloksia ja osoittivat merkittäviä licl-pitoisuuksia niinkin alhaisilla kuin 2 mM: n LiCl-pitoisuuksilla, joilla havaittiin merkittävää punkkikuolleisuuden lisääntymistä (P < 0, 001, log-rank-testi; täydentävä taulukko S2). Suuremmat 10 mM: n ja 25 mM: n pitoisuudet sekä lisäsivät merkitsevästi punkkikuolleisuutta hoidon toisesta päivästä alkaen että saivat yli 96% hoidetuista punkeista hävitettyä kokeen lopussa (Kuva. 1a, täydentävä taulukko S2). Kontrollikokeissa, joissa Rehuliuoksessa ei ollut LiCl: ää, punkkikuolleisuus oli keskimäärin 9,3%, joten se oli hyvin niiden punkkien kuolleisuusasteiden rajoissa, joita pidettiin käsittelemättömillä mehiläisillä erilaisissa ympäristöolosuhteissa 33. Näiden tulosten perusteella varmistimme licl: n selvän vaikutuksen punkkien elinkykyyn pitoisuusalueella 2-25 mM.

kuolleisuus Varroa-punkit ja mehiläiset häkkimehiläisten litiumkloridiruokinnan (LiCl) jälkeen. a) Kaplan–Meier-eloonjäämiskäyrä naarasmehiläisissä, joita pidetään LiCl: llä ruokituissa häkkimehiläisissä pitoisuuksina 2-25 mM (n = 33, 9, 9, 12 ja 9 häkkiä 0 mM: n (kontrolli), 2 mM: n, 4 mM: n, 10 mM: n ja 25 mM: n häkeissä). Kaikilla pitoisuuksilla punkkien eloonjääminen hoitoryhmissä oli merkitsevästi erilaista kuin kontrolliryhmässä (P < 0, 001, log-rank-testi Bonferroni-korjauksella). B) Kaplan-Meier-eloonjäämiskäyrä häkkiin joutuneiden työmehiläisten ja naaraspuolisten Varroapunkkien osalta 24 tunnin LiCl-altistuksen jälkeen (N = 9 häkkiä). Punkkien eloonjääminen hoitoryhmässä poikkesi merkitsevästi kontrolliryhmästä (P < 0, 001, log-rank-testi), mutta ryhmässä ei havaittu merkittäviä eroja mehiläisten kuolleisuudessa.

näissä kokeissa häkkimehiläisiä ruokittiin vastaavalla LiCl-pitoisuudella useiden päivien ajan, kunnes hoito tappoi kaikki punkit. Mehiläishoitokäytännön mahdolliselle käytölle olisi kuitenkin suotavaa lyhentää ja määritellä hoitojakso. Siksi teimme ylimääräisen kokeen, jossa tehokkain pitoisuus 25 mM LiCl (Kuva. 1A) annettiin 24 tuntia ja sen jälkeen ruokittiin sokeriliuoksella vielä kuusi päivää. Tarkkailujakson lopussa 92.9% punkeista (n = 225 punkkia, p < 0, 001, log-rank-testi) kuoli ilman merkittävää vaikutusta hoidettuihin mehiläisiin (KS.seuraava kappale). Tämä tulos osoittaa selvästi, että jopa lyhytaikainen 25 mm: n LiCl: n ruokinta riittää vähentämään merkittävästi punkkipopulaatiota.

jotta voitaisiin tarkasti määrittää mehiläisten nauttima määrä LiCl: ää, joka on tarpeen loisia aiheuttavien punkkien tappamiseksi, 12 vastakuoriutuneelle Mehiläiselle syötettiin keinotekoisesti 10 µl LiCl-liuosta, jonka koko oli 4-100 mM, ja niitä pidettiin yksittäin fosforipunkin kanssa viiden päivän ajan häkeissä. 4 mM: n ja 10 mm: n liuoksilla, jotka vastasivat 1, 7 µg: n ja 4, 2 µg: n licl: n kertymää, vaikutus ei eronnut merkitsevästi käsittelemättömästä kontrollista (n = 12 punkkia, P = 1, 000, log-rank-testi, täydentävä taulukko S3). Kuitenkin 25 mM: n kerta-annos, joka vastaa 10,6 µg: ta mehiläisen kuluttamaa LiCl: ää, riitti tappamaan 100% fosforipunkeista 48 tunnin kuluessa (Kuva. 2).

sellaisten fosforipitoisten Varroapunkkien kuolleisuus, joita pidettiin mehiläisissä, joille annettiin yksittäin 10 µl litiumkloridiliuosta pitoisuuksina 4 mM-100 mehiläisiä ruokittiin vain kerran kokeen alussa, minkä jälkeen ne saivat sakkaroosisiirappia viiden päivän ajan. Kutakin pitoisuutta kohti analysoitiin 12 häkkiä, joissa kussakin oli yksi mehiläinen ja yksi Varroapunkki. Punkkien eloonjääminen heikkeni merkittävästi kontrolliryhmään verrattuna, kun mehiläisille syötettiin vähintään 25 mM: n pitoisuuksia (P < 0, 001, log-rank-testi).

vaikutus työmehiläisiin

LiCl: n siedettävyyden analyysissä työmehiläisille testihäkit, joita käytettiin punkkikuolleisuuden analysointiin (Kuva. 1A) kirjattiin lisäksi työmehiläisten kuolleisuus. Altistuksen jälkeen 2 mM: n, 10 mM: n ja 25 mm: n LiCl-pitoisuuksille, joilla on osoitettu olevan licidaalista vaikutusta, hoidettujen työläismehiläisten kuolleisuus vaihteli keskimäärin 3-7%: n välillä eri ruokintaryhmissä. 10 mM: n LiCl-ryhmää (n = 12 häkkiä, P = 0, 015, log-rank-testi; täydentävä taulukko S4) lukuun ottamatta arvot eivät poikenneet merkitsevästi 4%: n kuolleisuudesta käsittelemättömässä kontrolliryhmässä. Lisäksi kontrolliemme kuolleisuusluvut olivat hyvin käsittelemättömien häkkimehiläisten kuolleisuuden rajoissa, joita tarvitaan toksikologisissa testeissä34, mikä vahvistaa testausjärjestelmämme pätevyyden. Myöskään 24 tunnin LiCl-hoito ei vaikuttanut työmehiläisten kuolleisuuteen (Kuva. 1b; n = 9 häkkiä, P = 0,308, log-rank-testi). LiCl: n hyvä siedettävyys mehiläisille vahvistettiin myös yhden annoksen ruokinnalla (punkkikuolleisuuden osalta ks.Kuva. 2) Tämä ei lisännyt merkittävästi työntekijöiden mehiläiskuolleisuutta (P = 1 000, log-rank-testi; täydentävä taulukko S5).

seuraavaksi LiCl: ää syötettiin jatkuvasti eri pitoisuuksina, kunnes viimeinen häkkimehiläinen kuoli pitkäaikaisen altistumisen aiheuttaman vasteen tutkimiseksi. Tässä tapauksessa käsittely lyhensi vastakuoriutuneiden työmehiläisten keskimääräistä elinikää merkittävästi käsittelemättömissä kontrollihäkeissä vietetystä 26 päivästä 23 päivään ja 10 millimetrin LiCl: n osalta 22 päivään (n = 60 mehiläistä, P = 0,024, log-rank-testi; täydentävä taulukko S6). Mehiläisillä, joiden pitoisuus oli suurin, 25 mm LiCl, elinikä lyheni merkittävästi keskimäärin 19 päivään (Kuva. 3 A).

hunajamehiläisten kuolleisuus litiumkloridin syöttämisen jälkeen häkkimehiläisille. a) Kaplan-Meier-eloonjäämiskäyrä häkkiin joutuneiden työmehiläisten kroonisessa LiCl-altistuksessa. LiCl-ravintoa, jonka pitoisuudet olivat 2 mM, 10 mM ja 25 mM, ruokittiin ad libitum-ravinnolla viimeisen mehiläisen kuolemaan asti (n = 6 häkkiä, joissa kussakin oli 10 mehiläistä). Kaikkien hoidettujen ryhmien eloonjääminen oli merkitsevästi erilaista kuin sokerisiirappikontrollissa (P < 0, 01, log-rank-testi Bonferroni-korjauksella). b) Kaplan-Meier-eloonjäämiskäyrä häkkiin joutuneista työmehiläisistä 24 tunnin LiCl-altistuksen jälkeen. 2 mM, 10 mM ja 25 mM: n pitoisuuksia sisältäville LiCl-lajeille syötettiin ad libitum-ravintoa ensimmäiset 24 tuntia kuoriutumisen jälkeen, minkä jälkeen ne korvattiin sakkaroosisiirapilla (n = 12 häkkiä, joissa kussakin oli 10 mehiläistä). Kaikkien hoidettujen ryhmien eloonjääminen ei eronnut merkitsevästi sokerisiirappivertailusta (P > 0, 1, log-rank-testi Bonferroni-korjauksella).

LiCl näyttää kuitenkin haittaavan mehiläisen elinkelpoisuutta vain, jos sitä annetaan pidempiaikaisena, kuten on osoitettu ylimääräisessä kokeessa, jossa LiCl: ää syötettiin ensimmäiset 24 tuntia kuoriutumisen jälkeen ja sen jälkeen se korvattiin sakkaroosisiirapilla, kunnes viimeinen häkkimehiläinen kuoli (Kuva. 3b). Vastakuoriutuneiden työmehiläisten keskimääräinen elinikä vaihteli 22 päivästä (10 mM) 24 päivään (kontrolli) ilman merkittäviä eroja käsittelyjen välillä (N = 120 mehiläistä käsittelyä kohti, P ≥ 0, 126, log-rank-testi; täydentävä taulukko S7). Näiden häkkimehiläisiltä saatujen tietojen perusteella voimme päätellä, että lyhytkestoinen Lisl-hoito riittää kitkemään Varroa-punkkitartunnan kokonaan, millä on vain vähän tai ei lainkaan vaikutusta työmehiläisten elinkelpoisuuteen. Nämä kontrolloiduissa olosuhteissa tehdyissä häkkitesteissä saadut tulokset ovat onnistunut ja lupaava ensimmäinen askel kohti uutta lähestymistapaa Varroa-hoitoon. Tehokkuus ja sivuvaikutukset on kuitenkin vahvistettava kenttäolosuhteissa.

kenttäkokeet litiumkloridilla keinotekoisissa parvissa

kenttäolosuhteiden arvioimiseksi testasimme 25 mM: n ja 50 mM: n LiCl: n yhdeksässä hautomattomassa keinotekoisessa parvessa, joissa kussakin oli kuningatar ja noin 20 000 mehiläistä. Nämä pitoisuudet valittiin häkkimehiläisillä tehtyjen aiempien kokeiden perusteella käyttäen suurinta annosta, jonka mehiläiset vielä sietivät lyhyinä annosteluaikoina (25 mM). Koska sakkaroosisiirapin tasainen jakautuminen koko noin 20 000 mehiläisen keinotekoiseen Parveen saattoi olla vaikeaa, testasimme lisäksi 50 mM LiCl-pitoisuuden varmistaaksemme, että jokainen mehiläinen altistui riittävälle määrälle litiumia. Niinpä parvia ruokittiin Ad libitum-valmisteella sakkaroosisiirapilla, joka sisälsi 25 mM LiCl: ää (n = 6) tai 50 mM (n = 3) kolmen päivän ajan, minkä jälkeen Perizin® – valmistetta annettiin paikallisesti. Perizin®, joka sisältää organofosfaattikumafossia vaikuttavana aineena, on erittäin tehokas varroasidi, jota käytetään yleisesti kontrollihoidon35. Punkkikuolleisuutta seurattiin viiden päivän ajan. Ennen kontrollikäsittelyä 25 mm LiCl tappoi noin 90% keinotekoisissa parvissa esiintyvistä punkeista (Taulukko 1). Suurempi konsentroitu liuos (50 mM) ei kuitenkaan lisännyt tätä vaikutusta (χ2-testi, P = 0,953). Kaiken kaikkiaan teho oli jonkin verran alhaisempi häkkitesteihin verrattuna. Yksi selitys voisi olla se, että LiCl: n jakautuminen tuhansien mehiläisten rykelmässä vaatii enemmän aikaa, kunnes viimeinen yksittäinen mehiläinen kuluttaa riittävän annoksen kyseisen loisia aiheuttavan punkin tappamiseksi. Tällaisten valtavien 20 000 mehiläisen ja enemmänkin kokonaisuuksien tarvittava ruokinta-aika on analysoitava lisäkokeissa.

muiden litiumyhdisteiden ja muiden kuin litiumsuolojen teho

vahvistaaksemme litiumin olevan aktiivinen komponentti Varroa-punkkien vaikutuksessa testasimme joukon litiumyhdisteitä ja vertasimme mitisidaalisia vaikutuksia muihin kuin litiumsuoloihin. Erityisen kiinnostavia olivat litiumsitraatti, yhdiste, jossa on kolme litiumionia, litiumsulfaatti ja litiumkarbonaatti, joissa on kaksi litiumionia verrattuna vain yhteen litiumioniin LiCl: ssä. Lisäyhdisteitä, joissa on yksi litiumioni (litiumlaktaatti, litiumasetaatti), mutta erilainen liukoisuus, kemiallinen reaktiivisuus ja hinta analysoitiin tehon ja siedettävyyden analysoimiseksi verrattuna LiCl: ään. Häkkikokeissa kaikki yhdisteet eliminoivat 100% punkeista 25 mM: n lämpötilassa kolmen (litiumsitraatti ja litiumasetaatti) – neljän päivän kuluessa (litiumsulfaatti, litiumlaktaatti ja litiumkarbonaatti). Myös 4-mM testiliuokset, täysin tappoi phoretic punkit viiden (litiumsitraatti, litiumsulfaatti, ja litiumasetaatti) seitsemään päivään (litiumlaktaatti) lukuun ottamatta litiumkarbonaattia (Taulukko 2; täydentävä taulukko S8).

työmehiläisten kuolleisuus ei lisääntynyt merkittävästi kummallakaan pitoisuudella verrattuna käsittelemättömiin verrokkimehiläisiin, lukuun ottamatta 25 mM litiumsulfaattia ja 25 mM litiumlaktaattia (täydentävä taulukko S9). Näillä kokeilla voisimme vahvistaa, että muilla litiumyhdisteillä on samanlainen potentiaali käytettäväksi systeemisenä punkkimyrkkynä. Tämä saattaa lisätä joustavuutta eläinlääkevalmisteen mahdollisessa suunnittelussa. Hinta huomioiden litiumkloridi ja litiumsitraatti ovat halvimpia yhdisteitä. Litiumsulfaatti soveltuu huonommin mehiläisten heikomman siedettävyyden vuoksi ja litiumkarbonaatti suhteellisen alhaisen vesiliukoisuuden vuoksi.

tutkiaksemme tarkemmin litiumyhdisteiden pitoisuusriippuvaista tehoa vertasimme LiCl: ää litiumsitraattiin (Li3C6H5O7), jolla oli suurin ero litiumionien määrässä molekyyliä kohti, viidellä eri pitoisuudella välillä 1-25 mM. Kaikilla litiumsitraattipitoisuuksilla oli merkitsevästi suurempi akarisidinen vaikutus kuin LiCl: llä, mutta mehiläisten kuolleisuudessa ei ollut eroa (Taulukko 3, Lisätaulukot S9 ja S11). Siksi litiumsitraatti saattaa edustaa vielä parempaa vaikuttavaa ainetta.

litiumpitoisena kontrollina ja kloridin poissulkemiseksi aktiivisena aineena testasimme myös emäksiset suolat natriumkloridi (NaCl) ja kaliumkloridi (KCL) sekä magnesiumkloridi (MgCl) 25 mM: ssä. emme havainneet varroakidaalista vaikutusta NaCl: lle tai KCl: lle (N = 3 häkkiä, P = 1.000, log-rank-testi, täydentävä taulukko S12). Mgcl-testeissä 100% häkkimehiläisistä kuoli viiden päivän kuluessa (P < 0.001, log-rank-testi), ja mehiläisten vähenevän määrän mukaan koe lopetettiin ennen kuin vaikutusta punkkiin ehdittiin analysoida. Näiden kokeiden perusteella tulimme siihen tulokseen, että litium todella välittää akarisidista aktiivisuutta annosriippuvaisesti ja että litiumsitraatilla on kaikista tähän mennessä testatuista yhdisteistä suotuisimmat ominaisuudet.

Litiumyhdisteiden potentiaali uutena varroasidina

olemme osoittaneet, että alun perin oletetut kaksijuosteiset RNA: t välttämättömiä Varroa-geenejä vastaan, mutta yllättäen litiumsuolat välittävät voimakasta akarisidista vaikutusta Varroa-punkkiin häkkimehiläisissä ja keinotekoisissa parvissa. Nämä tulokset osoittavat, että litiumyhdisteet edustavat uutta akarisidisten aineiden luokkaa, jonka potentiaali on erinomainen ja jonka siedettävyys mehiläisillä on huomattavan hyvä. Punkkien ja mehiläisten erilainen alttius LiCl: lle on vielä merkittävämpi, kun otetaan huomioon, että laimennusvaikutusten vuoksi LiCl: n pitoisuus mehiläisten hemolymfissa on todennäköisesti huomattavasti pienempi kuin mehiläisille syötetty pitoisuus.

tärkeää on, että havaintomme eivät viittaa siihen, että RNAi-pohjaisten lähestymistapojen akarisidiset vaikutukset, jotka Garbian et al on julkaissut.32 ovat yleensä licl: n välittämiä. Syötettyään dsRNA-seosta mehiläisille 60 päivän ajan, Garbian et al.32 punkkikuolleisuus lisääntyi hitaasti, ja hoidon lopullinen teho oli vain 60%. Kun otetaan huomioon keinotekoisten parvien nopea ja erittäin tehokas vastaus LiCl: n hoitoihin, eri toimintatavat ovat todennäköisiä: vaikka RNAi-välitteiset vaikutukset näyttävät aiheuttavan pitkäaikaisia vaikutuksia, litiumyhdisteet edustavat itsenäistä mekanismia, jolla on nopeasti alkava ja korkea teho.

varroasidina LiCl näyttää joitakin ominaisuuksia, jotka ovat ainutlaatuisia tässä yhdistelmässä: (i) LiCl vaikuttaa systeemisesti hunajamehiläisten ruokinnan kautta (”helppo käyttää”), (ii) se on vesiliukoinen eikä siksi Kerry mehiläisvahaan,mikä on keskeinen ongelma pitkäaikaiskäsittelykäsitteissä, joissa käytetään synteettisiä varroasideja lipofiilisillä ominaisuuksilla36, 37 (iii) useimpien litiumyhdisteiden myrkyllisyys nisäkkäille suun kautta on suhteellisen alhainen 38 (iv) sillä ei ole hylkivää vaikutusta ruokintaliuokseen asiaankuuluvalla pitoisuusalueella 2-25 mM39 ja (v) sitä on saatavilla kohtuulliseen hintaan. Erittäin lupaavaa on se, että vain 10 µl LiCl: ää 25 mM: n liuoksessa (vastaa 10, 6 µg: n LiCl: n annosta) yksittäistä mehiläistä kohti riittää fosforipunkkien tappamiseen. Haasteena jatkotutkimukselle on älykkään levitystekniikan kehittäminen täysikokoisia parvia ja yhdyskuntia varten sen varmistamiseksi, että kaikki mehiläiset saavat kriittisen määrän aktiivista yhdistettä.

tällä hetkellä emme tiedä, miten licl tappaa phoretic Varroapunkit, ja licl: n vaikutuksesta insects40: ssä on vain vähän julkaisuja. Ihmislääketieteessä litiumia on käytetty 1870-luvulta lähtien, ja se on maanisten jaksojen hoitoon ja kaksisuuntaisen mielialahäiriön ylläpitohoito41. Litiumyhdisteet ja niiden toksisuusprofiili on niiden terapeuttisen käytön vuoksi tutkittu huolellisesti. Tähän mennessä mahdollisiksi targeteiksi on ehdotettu useita aineenvaihduntaan, kehitykseen, hematopoieesiin ja muihin prosesseihin vaikuttavia entsyymejä 42,43. Nämä entsyymit vaativat metalli-ioneja ja litium vaikuttaa kilpailemattomalla tavalla, mikä todennäköisesti tapahtuu syrjäyttämällä kaksiarvoinen kationi. Meillä ei tosin ole tällä hetkellä mitään viitteitä siitä, että litiumyhdisteiden havaittu meditisidaalinen vaikutus perustuisi vastaavaan vaikutustapaan.

olemme myös tietoisia siitä, että tuloksemme ovat vasta ensimmäinen askel kohti uuden eläinlääkevalmisteen kehittämistä. Vapaasti lentävissä yhdyskunnissa tehtävät kenttäkokeet ovat aivan yhtä välttämättömiä kuin aikuisten mehiläisten ja mehiläisten jälkeläisten subletaalisten ja pitkäaikaisten haittavaikutusten sekä hunajajäämäongelmien analysointi.

tässä esitetyt tulokset osoittavat kuitenkin jo, että LiCl: llä on potentiaalia tehokkaaksi ja helposti sovellettavaksi hoidoksi keinotekoisille ja luonnollisille parville ja erityisesti pölytykseen käytettyjen pakkausmehiläisten valtavalle määrälle11,44. Lisäksi vaikutusmekanismin selvittäminen voisi avata uusia mahdollisuuksia Eläinlääkintätuotteiden kohdennetulle kehittämiselle Varroa-punkkien torjumiseksi.