PMC

Kaksoisjuosteen katkeaminen DNA: ssa voi aiheuttaa tuhoa soluissa, jos sitä ei korjata. Siksi ehdotettiin, että kromosomien päät voivat olla erikoistuneita korkkirakenteita, joita ei tunnisteta kaksijuosteisiksi katkoksiksi, mikä estää solusyklin pysähtymisen, hajoamisen ja rekombinaatiofuusion (Muller, 1938; McClintock, 1939). Tiedämme nyt, että telomeerit muodostavat kromosomien päät ja ovat välttämättömiä perimän pysyvyydelle. Telomeerit koostuvat tandemin päästä häntään toistoja lyhyen g-rikas sekvenssi; esimerkiksi ihmisen telomeerit ovat 2-20 kb (TTAGGG) n toistoja. Kromosomin päät eivät ole tylppiä, ja 3′-päätteinen (g-rikas juoste) uloke yksittäisessä juosteessa, joka voi tunkeutua telomeerin sisäosiin syrjäyttäen sisäisen g-rikkaan sekvenssin ja muodostaen T-silmukan rakenteen (Griffith et al., 1999; Cesare et al., 2003; Doksani et al., 2013), jolloin kromosomin päät suojataan siten, ettei solu tunnista niitä kaksijuosteisiksi katkoksiksi, minkä lisäksi telomeeriä sitovat proteiinit suojaavat niitä.

eukaryoottiset kromosomit monistuvat puolikonservatiivisella replikaatiolla, jossa on johtava (jatkuva synteesi nettokasvulle orastavan johtolangan 3′ päässä) ja viiveellä (epäjatkuva Okazaki-fragmenttisynteesi nettokasvulle orastavan juosteen 5′ päässä) venyvä juoste kuten kuvassa. 1. Kromosomin semikonservatiivisessa replikaatiossa orastavasta säikeestä poistetaan lyhyt 5′ RNA-alkio ja aukko täytetään DNA: lla, joka on kiinnittynyt viereiseen orastavaan DNA: han. Kromosomin päässä olevaa 5′ terminaalisen RNA-primerin poiston jälkeistä aukkoa ei kuitenkaan voida täyttää, ja kromosomi voi lyhentyä jokaisen sitä seuraavan replikaatiokierroksen myötä. Tätä on kutsuttu lopun replikointiongelmaksi (Watson, 1972; Olovnikov, 1973), ja telomeraasi auttaa ratkaisemaan tämän ongelman (Greider and Blackburn, 1987; Soudet et al., 2014).

Semikonservatiivinen replikaatio tapahtuu ennen telomeraasin toimintaa. Aiemmin ajateltiin, että DNA: n replikaatio alkoi telomeerien viereisen kromosomaalisen DNA: n alkuperästä, jolloin replikaatiohaarukat liikkuivat kaksisuuntaisesti pois subtelomeerisesta alkuperästä (Kuva. 1 A), jolloin telomeeri toistuu. Kysymys jäi kuitenkin siitä, voisiko DNA: n replikaatio alkaa jollakin taajuudella itse telomeerissa (Kuva. 1). Tähän kysymykseen on nyt vastattu myöntävästi tässä numerossa drosopoulos et al., who used single molecule analysis of replikated DNA (SMARD; Norio and Schildkraut, 2001). Tässä lähestymistavassa monistuvat solut merkitään peräkkäin kahdella eri nukleotidianalogilla, jotka tunnistetaan myöhemmin immunofluoresenssilla. Esimerkiksi kaksisuuntaisessa replikaatiossa ensimmäisen pulssin punaisia signaaleja reunustetaan molemmista päistä toisen pulssin vihreillä signaaleilla. Aikaisemmat raportit käyttäen SMARD oli päätellyt, että useimmat replikaation aloittaa subtelomeerinen alueilla hiiren ja ihmisen genomin ja harvoin telomeerit itse (Sfeir et al., 2009; Drosopoulos et al., 2012). Tuoreessa tutkimuksessa drosopoulos et al. (2015), fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) käyttäen koettimia telomere-alueelta salli replikaatiokuvion analysoimisen 320 kb genomiselle segmentille hiiren kromosomi-käsivarren 14q päästä. johtuen pitkästä ajasta (4 h) ensimmäiselle (punainen) pulssille, yleensä vain punaiset signaalit telomeerin sisällä nähtiin, mutta koska monilla tällaisilla molekyyleillä ei ollut punaista signaalia ulottumaan subtelomeeriselle alueelle, voidaan mukavasti päätellä, että replikaation on täytynyt alkaa telomeerissa (Kuva . 1). Lisäksi joidenkin molekyylien telomeerissa oli punainen signaali vihreän signaalin rinnalla, mikä tukee tätä päätelmää. Vaikka näissä tapauksissa oli kromosomi-proksimaalinen vihreä signaali, kromosomi-distaalinen vihreä signaali näkyi harvoin. Näin ollen, vaikka telomeerista peräisin olevasta kaksisuuntaisesta replikaatiosta oli vain vähän näyttöä, on hyvin selvää, että replikaatioalkuperä voi olla olemassa varsinaisessa telomeerissa, kun replikaatiohaarukka ulottuu ajan kuluessa subtelomeeriin. On vielä tutkittava, alkaako replikaatio suhteellisen suurella taajuudella muiden kuin 14Q: n kromosomien telomeereissa.

nämä löydökset herättävät kysymyksen siitä, onko DNA: n replikaation alkuperä sama kuin telomeereissa havaittu yksinkertainen sekvenssiuudistus vai onko se sama jonkin muun telomeerin sisällä mahdollisesti olevan sekvenssin kanssa. Edellistä ehdotetaan tutkimuksessa Xenopus-soluttomilla uutteilla, jotka voisivat koota esireplikaatiokompleksin ja suorittaa jonkin verran DNA-replikaatiota eksogeenisella DNA: lla, joka sisältää yksinomaan telomeerisia toistoja (Kurth and Gautier, 2010). Samanlaisia päätelmiä, että DNA replikaatio voi aloittaa yksinkertainen DNA toistuu löytyy centromeers jossa replikaatiokuplia on havaittu Drosophila virilis elektronimikroskopialla on saavutettu (Zakian, 1976), ja tuore tutkimus viittaa siihen, että DNA replikaatio alkaa sisällä ihmisen alfa-satelliitin DNA (Erliandri et al., 2014).

Replikaatiohaarukat liikkuvat hitaasti telomeerisen DNA: n läpi (Ivessa et al., 2002; Makovets et al., 2004; Miller ym., 2006; Sfeir et al., 2009) johtuen GC-rikkaan telomeerisen DNA: n korkeasta lämpöstabiilisuudesta sekä sen taipumuksesta muodostaa vakaita sekundaarirakenteita, kuten G-quadruplex (G4) DNA, joka voi aiheuttaa ongelmia DNA: n replikaatiolle (Lopes et al., 2011; Paeschke et al., 2011). Erilaiset helikaasit auttavat ratkaisemaan tämän ongelman; esimerkiksi Pif1-helikaasi auttaa purkamaan G4 (Paeschke et al., 2013). Bloomin oireyhtymä helicase (BLM) ja Wernerin oireyhtymä helicase (WRN) on myös liitetty avustamaan telomere replikaatio: BLM estää replikaatiosta riippuvia hauras telomeerit (Sfeir et al., 2009), ja WRN tukahduttaa vikoja telomere lagging strand synteesi (Crabbe et al., 2004). Drosopoulos ym. (2015) raportoi nyt, että johtava juostesynteesi, joka aloittaa sisällä telomeeri on hitaampi etenemisnopeus subtelomere BLM-puutteellinen solujen visualisoitu SMARD. Lisäksi 14Q: n alatelomeerissa oli enemmän replikaatiokäynnistyksiä BLM-puutteellisissa soluissa, jotka olivat peräisin lähempänä telomeeriä kuin BLM-kyvykkäissä soluissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että lepotilassa olevat replikaatioalkuperät 14Q-alatelomeerissa voivat aktivoitua, kun haarukan eteneminen estyy BLM-puutteellisissa soluissa (Fig. 1 C). Drosopoulos ym. (2015) havaitsi myös subtelomeerisen replikaation aloittamisen lisääntymisen, kun replikaatiohaarukan etenemistä telomeerista estettiin kirvalla, vaihtoehtoisena keinona aktivoida lepotilassa olevaa alkuperää replikaatiostressillä. Kun soluja käsiteltiin g4-stabilointiaine PhenDC3: lla, 14Q: n subtelomeerinen alkuperäpoltto lisääntyi entisestään BLM-puutteellisissa soluissa. Yhdessä tiedot viittaavat johtavan juostesynteesin etenemisen hidastumiseen 14Q: n telomeerista (käyttäen G-rich parental strand-mallia), kun G4-rakenteita ei voida ratkaista BLM-puutteellisissa soluissa. Lisätukena BLM-helikaasin roolille g4-rakenteiden poistamisessa bg4-vasta-aine lisäsi värjäytymistä BLM-puutteellisissa soluissa (Biffi et al., 2013) g4: ää vastaan koko genomissa ja erityisesti telomeereissa.

WRN helicase can unlowind G4 in vitro (Fry and Loeb, 1999; Mohaghegh et al., 2001). Kun Drosopoulos et al. (2015) käytetään SMARD analysoida replikointia soluissa kaksinkertaisesti puutteellinen sekä BLM ja WRN, he löysivät merkittävä lasku punaisen replikointisignaalin 14Q telomeerit, mikä viittaa joitakin toiminnallisia päällekkäisyyksiä BLM ja WRN osalta johtava juosteen synteesin pois g-rikas juosteen telomeerit. Tätä päätelmää tukee se, että bg4-vasta-aineen g4-värjäystä oli enemmän soluissa, joilla oli kaksin verroin sekä BLM: n että WRN: n puute kuin soluissa, joilla oli vain BLM: n tai vain WRN: n puute. Tämä on ensimmäinen suora demonstrointi in vivo BLM-ja WRN-helikaasien osuudesta g4-rakenteiden resoluutiossa, jota tarvitaan erityisesti telomeereissa alkavan johtavan juostesynteesin etenemiseen ja joka kopioidaan g-rikkaasta säikeestä.