the Embryo Project Encyclopedia
vuosina 1958-1961 yhdysvaltalaiset Leonard Hayflick ja Paul Moorhead kehittivät laboratoriossa tavan viljellä ihmissolukantoja täydellisillä kromosomeilla. Aiemmin tutkijat eivät voineet säilyttää soluviljelmiä sellaisilla soluilla, joilla oli kaksi täydellistä kromosomien sarjaa, kuten normaalit ihmissolut (diploidi). Tämän seurauksena tiedemiehet ryhtyivät tutkimaan ihmisen solubiologiaa, koska ei ollut olemassa luotettavaa solulähdettä, joka edustaisi diploidisia ihmissoluja. Vuonna theirexperiments, Hayflick ja Moorhead luonut pysyviä kantoja humancells, joka säilytti molemmat täydelliset kromosomit. Ne sitten frozesamples viljelmistä niin, että solut pysyivät elinkelpoisina futureresearch. He panivat myös merkille, että solut saattoivat jakautua vain tietyn määrän kertoja, ennen kuin ne hajosivat ja kuolivat. Hayflickin ja Moorheadin kokeessa tutkittiin kehitysbiologiaa ja rokotteita, jotka perustuivat humancellin kantoihin.
Hayflick erikoistui solujen viljelyyn kontrolloiduissa ympäristöissä. Vuonna 1958 hän liittyi Philadelphiassa Pennsylvaniassa solubiologiaa ja viruksia tutkineeseen Wistar-instituuttiin instituutin uuden johtajan Hilarykoprowskin kutsusta. Koprowski antoi hayflickille tehtäväksi luoda soluviljelmiä käytettäväksi instituutin muiden tutkijoiden kokeissa. Hayflicklater kuitenkin muistutti, että hän käytti tutkimustehtäväänsä mahdollisuutena tutkia soluviljelmien menetelmiä ja rajoituksia. Solukulttuuriin Hayflick värväsi Wistar-kollegansa Paul Moorheadin, joka tutki solujen ja kromosomien rakennetta ja toimintaa.
normaalien ihmissoluviljelmien pitkäikäisyyden puute laboratoriossa rajoitti tutkimusta, jota tutkijat pystyivät tekemään. Solukulttuurien avulla tutkijat kasvattavat lasitavaroiden solupopulaatioita tutkimuskäyttöön. Tutkijat kasvattavat tyypillisesti lasiviljelmiä tai petrimaljoja,jotka sisältävät kasvualustaa, liuosta, joka sisältää liuenneita suoloja, sokereita ja muita soluravinteita. Koko ensimmäisen puoliskon kahdennenkymmenennen vuosisadan,tutkijat olettivat, että kaikki normaalit, terveet soluviljelmät oli aninnate kyky jakaa loputtomiin perustuu aikaisempiin löytöihinjulkisti biologi Alexis Carrel vuonna 1912 Yhdysvalloissa. Käytännössä tutkijat eivät kuitenkaan havainneet loputonta jakautumista normaaleissa soluissa.Sen sijaan viljelmän solut lopulta hajosivat ja kuolivat. Tutkijat arvelivat, että solut hajosivat, koska ne olivat kuluttaneet viljelmän kasvualustan kaikki ravintoaineet loppuun tai koska laboratorioteknikot eivät olleet onnistuneet ylläpitämään ihanteellisia ympäristöolosuhteita solujen kasvulle. Ainoita ihmissoluja, jotka jakaantuivat jatkuvasti laboratoriolinjoiksi kutsuttuihin kuolemattomiin solulinjoihin, olivat syöpäsoluista johdetut solut. Nämä solulinjat edustivat vain joitakin ihmisen solubiologian aspekteja.
1900-luvun puolivälissä lääketieteen tutkijat eivät kyenneet selittämään, mikä aiheutti syövän, ja monet tutkijat,kuten Hayflick ja Moorhead, arvelivat, että tietyt virukset voivat aiheuttaa syöpäkasvaimia. Vaikka monet mikrobiologit käyttivät syöpäsolulinjoista johdettuja soluja lääketieteellisessä tutkimuksessa, soluja ei yleensä käytetty rokotteiden kehittämisessä, koska tutkijat pelkäsivät, että rokotteet saastuisivat syöpää aiheuttavista viruksista, jotka mahdollisesti sisältyvät itse soluihin. Lisäksi syöpälinjojen solut olivat jatkuvan jakautumisensa vuoksi heteroploidisia, eli niillä oli joko suurempi tai suurempi kromosomiluku kuin normaaleilla ihmissoluilla, joilla on kaksi täydellistä kromosomijoukkoa. Heteroploidiset solut johtuivat usein jatkuvasta solunjakautumisesta useiden solusukupolvien ajan.
Hayflick ja Moorehead tuottivat ihmissoluja, jotka saattoivat viljeltyä useiden sukupolvien ajan, kuten syöpäsolulinjojen solut, mutta myös säilyttivät solujen diploidisen kromosomimäärän ja vähensivät teoreettisten syöpää aiheuttavien virusten riskiä. He kuvasivat kokeensa vuonna 1961 julkaistussa teoksessa” The Serial culture of Human DiploidCell Strains”.
Hayflick ja Moorhead pyrkivät kehittämään ihmissolukantoja, joita voitiin viljellä laboratoriossa pitkiäkin aikoja, mutta jotka silti säilyttivät diploidisen kromosomimääränsä. He olettivat, että jos he siirtäisivät pieniä näytteitä diploidisista ihmissoluista jo kasvavista viljelmistä uuteen kasvuympäristöön, he lisäisivät huomattavasti diploidisten solujen määrää viljelmässä. Hayflick ja Moorhead ehdottivat, että pakastamalla pieniä määriä diploidisia soluja pysäyttäisi sellulaarikasvun ja jakautumisen tappamatta soluja. Jäätyneitä soluja voitiin varastoida, kunnes tutkijat tarvitsivat niitä, jolloin jäätyneet solut voitiin poistaa ja palauttaa normaaliin solujen toimintaan.Hayflick ja Moorhead ennustivat, että sulamisen jälkeen viljellyt solut eivät muuttuisi heteroploidisiksi muiden linjojen solujen tavoin ja säilyttäisivät diploidisen kromosomijoukkonsa.
Hayflickin ja Moorheadin Experimentin tarkoituksena oli sekä luoda menetelmä ihmisen diploidisolujen kasvattamiseksi laboratoriossa pitkäaikaiseen tutkimuskäyttöön että selvittää, ovatko nämä solukannat myötävaikuttaneet syöpäkasvaimiin.Hayflick ja Moorhead kasvattivat ensin ihmisen soluja laboratoriokasvatuskulttuureissa, siirsivät pieniä solunäytteitä uusiin säiliöihin kasvattamaan lisää soluviljelmiä ja jäädyttivät näiden viljelmien solunäytteitä säilyttääkseen solut myöhempää tutkimusta varten. Seuraavaksi hayflick ja Moorhead testasivat, olivatko jäätyneet solut vielä elinkelpoisia tutkimusta varten, ja yrittivät kasvattaa niistä soluviljelmiä.Lopuksi he istuttivat näytteitä noista ihmisen diploidisista solukannoista eläviin kudoksiin nähdäkseen, johtivatko ne syöpäkasvaimiin.
kehittääkseen difloidisia ihmissolukantoja Hayflick ja Moorhead alkoivat viljellä soluja 25 erilaisesta kudoksesta, jotka oli saatu abortoiduista sikiöistä. Näistä soluista tuli 25 eri ihmisen solukantaa, jotka nimettiin numeerisesti WI-1THROUGH WI-25: ksi. WI edusti Wistar-instituuttia, jossa sellirakennuksia kehitettiin. Hayflick ja Moorhead käyttivät sikiön kudoksia, koska enemmän kuin aikuisten solut, sikiön solut helpommin kehittyivät fibroblastisoluihin, jotka ovat erikoistuneita soluja, jotka tarjoavat rakenteellista tukea useimmille kehon kudoksille. Fibroblastisoluja ei voitu käyttää laboratoriosoluviljelyyn, koska ne kasvoivat nopeasti ja jatkuvasti soluviljelmissä ja tarjosivat runsaasti soluja tutkimusta varten. Hayflick ja Moorhead leikkasivat kudosnäytteet pieniksi, ohuiksi suikaleiksi ja istuttivat ne sitten ravinteikkaalla kasvualustalla täytettyjen lasipullojen sisäseinään. Hayflick ja Moorheadthen asettivat kunkin solukannan kudospinnoitetut pullot lämpimään ympäristöön kolmeksi päiväksi ja korvasivat kasvualustan säännöllisesti tuoreella ravinnolla, jotta soluviljelmä alkoi kasvaa.
Hayflick andMoorhead antoi viljelmien kasvaa, kunnes solut peittivät koko lasipullon. Sen jälkeen jokainen sikiön solunäyte jaettiin osiin prosessinimitetyllä alakulttuurilla. Alakasvatuksen aikana Hayflick ja Moorhead poistivat pienen solunäytteen ja istuttivat solut uuden kasvualustalla täytetyn lasipullon seinään, jolloin syntyi uusi saman solukannan soluviljelmä. Jokainen uusi solukultti perusti uuden solusukupolven, jota voitiin itse jatkaa viljelemällä samalla menetelmällä, jolloin solujen kokonaismäärä kasvoi eksponentiaalisesti. Hayflick ja Moorhead jakoivat jäljelle jääneistä soluista näytteitä pieniin osiin ja jäädyttivät ne pysäyttääkseen solujen kasvun ja pysäyttääkseen solujen jakautumisen.
Hayflick ja Moorhead jatkoivat alakasvatussoluja kahdesti viikossa noin kymmenen kuukauden ajan, jolloin soluviljelmät lakkasivat kasvamasta ja alkoivat hajota.Hayflick ja Moorhead olettivat, että solut olivat lakanneet jakamasta, koska kasvualustassa oli kerääntynyt solukasvun myrkyllisiä tuotteita. Hayflick ja Moorhead yrittivät tuoda markkinoille tuoretta kasvimediumia, jossa ei ollut myrkkyjä, mutta solukulttuurit jatkoivat hajoamistaan ja kuolemaansa seuraavien kuukausien aikana. Muut samaan kasvualustaan sijoitetut soluviljelmät eivät kuitenkaan hajoaneet ja kuolleet. Tutkijat päättelivät, että jokin soluissa itsessään, ei niiden ympäristössä, aiheutti niiden rappeutumisen.
Hayflick ja Moorhead yrittivät seuraavaksi selvittää, voitaisiinko jäätyneitä soluja vielä käyttää kasvattamaan lisää solukasveja. Kun pienet solunäytteet oli sulatettu, Hayflick ja Moorhe laittoivat kennot lasipullojen seiniin. He viljelivät niitä uudelleen kasvualustalla ja havaitsivat, että vielä pakastuksen jälkeenkin solut kasvoivat uusissa viljelmissä, jotka saattoivat itse olla alakasvatettuja. Riippumatta aiemmasta jäädyttämisestä tai alakulttuurista tutkijat voisivat käyttää diploidisten ihmissoluviljelmien näytteitä kasvaakseen lisää diploidisia ihmissoluviljelmiä. Hayflick ja Moorhead olivat luoneet adiploidisen ihmissolukannan, jota voitiin viljellä laboratoriokulttuureissa loputtomiin.
Hayflick ja Moorhead tutkivat tämän jälkeen, olivatko uusissa viljelmissä kasvatetut solut diploidisia. Kokeesta kirjoittaessaan he kertoivat olevansa huolissaan siitä, että solut eivät ole pysyneet diploidisina, koska ne ovat kasvattaneet niitä useiden sukupolvien ajan, mikä voi johtaa heteroploidiaan. Valomikroskooppien avulla Hayflick ja Moorhead tarkastelivat solunäytteitä solunjakautumisen metafaasin aikana, jolloin kromosomit ovat erillisiä ja helposti tarkasteltavia. He laskivat kromosomien määrän 250 yksilössä saadakseen arvion siitä, kuinka monessa solussa oli vielä adiploidisia kromosomeja. Hayflick ja Moorhead määrittivät, että yli 97 prosenttia soluista oli diploidisia jopa yli kahdenkymmenensukuisen alakulttuurin jälkeen. Hayflick ja Moorhead päättelivät, että sikiöiden solujen sarjaviljely ja pakastaminen oli tehokas menetelmä diploidisen ihmissolukannan säilyttämiseksi.
lopulta Hayflickin ja Moorheadin oli osoitettava,että heidän solukantansa eivät aiheuttaneet syöpää. Syöpäsoluista luotujen kuolemattomien solulinjojen ongelmana oli, että tutkijat olettivat solujen voivan pitää syöpää aiheuttavia viruksia. Varmistaakseen, etteivät heidän newcell-kantansa aiheuttaneet syöpää, Hayflick ja Moorhead testasivat thewi-25-solukantaa elävässä kudoksessa. He valitsivat WI-25-siivilän, koska se oli läpikäynyt eniten jakoja ja oli todennäköisesti syöpää aiheuttava solukanta. Siksi, jos se ei ollut, se oli likimain, että mikään muu kanta ei olisi myöskään.
tutkijat istuttivat WI-25-solukannan soluja viiden livinghamsterin poskipusseihin. Kokeellisena kontrolliryhmänä he istuttivat myös viiden muun hamsterin poskipusseihin syöpäsolulinjoista johdettuja soluja. Aluksi kyhmyt, varhainen merkki syövän kehittymisestä, näyttäytyvät molempien hamsterisarjojen tarkastuspusseissa. Kolmen viikon kuluttua lähes kaikki WI-25-kennoilla istutettujen hamstereiden kyhmyt olivat kuitenkin kadonneet, kun taas syöpäsolulinjoista istutettujen hamstereiden kyhmyt olivat kaikki kasvaneet kooltaan. Hayflick ja Moorhead suorittivat jäljellä olevista kyhmyistä koepaloja vahvistaakseen ennusteensa siitä, että heidän alakulttuurisensa solut eivät aiheuttaneet syöpää.Koepalat osoittivat, että kyhmyt hamstereissa, joihin oli istutettu soluja syöpäsolulinjoista, olivat todellakin syöpää, kun taas WI-25-solulinjat johtuivat tulehduksesta ja verenvuodosta implantaatiopaikalla.
Hayflick ja Moorhead istuttivat myös viiden kuolevan syöpäpotilaan lihaskudoksiin samanlaisen ihmisen soluaivon, WI-1: n.Hän istutti syöpäsolulinjoista soluja myös viiteen muuhun syöpäpotilaaseen. Kuten hamstereilla, aluksi kyhmyt grewat molempien ryhmien istutuspaikat. Parin päivän kuluttua theWI-1-solukyhmyt alkoivat vetäytyä, kun taas kyhmyt moninkertaistuivat syöpäsolulinjojen soluilla istutetuilla inpatienteilla. Viikon lopussa lähes kaikki WI-1-kyhmyt olivat kadonneet, ja Hayflick andMoorhead biopsioivat jäljellä olevat kyhmyt molemmista ryhmistä. Koepalojen tulokset osoittivat, että syöpäsolun kyhmyt olivat heteroploidisoluja, kun taas WI-1: n kyhmyt olivat diploidisia ja ei-syöpäisiä. Hayflickin ja Moorheadin havainnot, jotka he julkaisivat vuonna 1961,osoittivat, että ihmisen diploidisia soluja voitaisiin levittää useiden sukupolvien ajan, kuten syöpäsolulinjoja, muuttumatta heteroploidisiksi tai cancerousthemselvesiksi.
tuloksilla oli välitön ja pysyvä vaikutus kehitysbiologian ja tieteellisen tutkimuksen ymmärtämiseen. Heidän kokeensa tulokset vahvistivat Carrelin vuonna 1912 esittämän hypoteesin, jonka mukaan normaalit solut kasvoivat viljelmässä loputtomiin, vaikka soluviljelmien havaittiin hajoavan ajan myötä. Carrel oli esittänyt, että tämä johtui siitä, että solut käytännössä näyttivät rappeutuvan ja iän ylittäminen johtui solujen epätäydellisistä laboratoriokasvuolosuhteista.Carrel väitti, että ihanteellisissa olosuhteissa viljelmien solut voisivat jakautua loputtomiin ja toimia tehokkaasti kuolemattomana solulinjana.Hayflickin ja Moorheadin havainnot kuitenkin osoittivat, että vanheneminen tapahtuu solutasolla,prosessia kutsutaan vanhenemiseksi, ja että solut voivat käydä läpi vain rajallisen määrän jakaumia ennen kuin ne hajoavat ja kuolevat. Kokeensa aikana Hayflick ja Moorhead pyrkivät jatkuvasti viljelemään sikiösoluja, korvaten vanhan kasvualustan tuoreella, ravinnepitoisella väliaineella. He kuitenkin havaitsivat, että noin neljänkymmenen tai kuudenkymmenen sukupolven jälkeen solut alkoivat kuolla sen sijaan, että ne lisääntyisivät, ilmiötä kutsutaan myöhemmin Hayflickin rajaksi. Tämä osoitti, että solut eivät voi kasvaa loputtomiin inkulturaatio, edes ihanteellisissa olosuhteissa.
Hayflickin ja Moorheadin menetelmä ihmisen diploidisolujen sarjaviljelystä auttoi myös tutkijoita ylläpitämään runsaasti diploidisia ihmissoluja tutkimusta varten. Moorheadin laskelmien mukaan yksi ihmisen solukanta voisi olla tarpeeksi monta kertaa alakulttuurissa tuottaakseen lähes 20 tonnia elinkykyisiä soluja. Vaikka tuo varasto ei olisi teknisesti kuolematon, se loppuisi ehtymättömäksi käytännön tutkimustarkoituksiin.
lisäksi elinkelpoisten diploidisten ihmissolujen luominen mahdollisti rokotetutkimuksen.Koska Hayflick ja Moorhead osoittivat, että heidän ihmissolukantansa eivät aiheuttaneet syöpää hamstereissa tai ihmisissä, kyseisiä kantoja voitiin käyttää invacines-rokotteina ilman vaaraa, että rokote saastuisi jollain syöpää aiheuttavalla aineella. Myöhemmin samalla tavalla johdetuista ihmisen solukannoista, kuten WI-38: sta, tuli perusta lapsuudensairauksien, kuten vihurirokko-ja vesirokkorokotteille.
vaikka monet tutkijat suhtautuivat myönteisesti hayflickin ja Moorheadin ihmisen solukantojen kehittämiseen, jotkut,mukaan lukien katolinen kirkko, paheksuivat abortoidun fetalmateriaalin käyttöä rokotteiden kehittämisessä uskonnollisista syistä. TheVatican ilmoitti myöhemmin vastustavansa sikiökudoksista johdettujen rokotteiden kehittämistapaa eikä sitä, ettäyksityinen käyttäisi kyseisiä rokotteita sairauksien ehkäisemiseen.
Hayflick ja Moorhead osoittivat paitsi,että ihmissoluja voitaisiin menestyksellisesti viljellä laboratoriossa säilyttäen silti diploidinen kromosomimäärä, myös, että ne voisivat säilyttää solut lähes määrittelemättöminä sarjamuotoisen alakulttuurin avulla. Lisäksi heidän kokeensa loi perustan Hayflickin solunjakautumiskulttuurin rajalle, jota myöhemmin kutsuttiin Hayflickin rajaksi. Hayflickin ja Moorheadin discoveries mahdollisti lisäkokeet kehitysbiologiassaja rokotteen kehittämisessä tarjoamalla runsaasti ihmisen soluja tutkimusta varten.