Xpert® MTB/RIF

toimittajille:

edistyminen tuberkuloosidiagnoosin laboratoriokapasiteetin parantamisessa johti sellaisten molekyylimääritysten kehittämiseen, jotka korvaavat nyt laajamittaisesti perinteiset mikroskopia-ja viljelmäpohjaiset menetelmät . Valitettavasti nykyiset molekyylitekniikat havaitsevat sekä eläviä että kuolleita bakteereja, eikä positiivinen tulos tarkoita taudinaiheuttajan elinkelpoisuutta. DNA voi säilyä pitkään bakteerikuoleman jälkeenkin, ja kuolleiden bakteerien nukleiinihappo on yhtä vahvistuvaa. Siksi molekyylimääritykset eivät sovellu hoidon seurantaan ja / tai infektioiden hallintaan.

raportoimme innovatiivisesta lähestymistavasta vahvistaa selektiivisesti elinkykyisestä Mycobacterium tuberculosis-bakteerista peräisin olevaa DNA: ta kliinisissä näytteissä, mikä on hyödyllistä keuhkojen tuberkuloosipotilaiden mykobakteeri-kuormituksen seurannassa TUBERKULOOSILÄÄKITYKSEN aikana.

protokolla perustuu näytteiden esikäsittelyyn propidium monoatsidilla (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, USA), kemiallinen yhdiste, joka voi interkaloida elinkyvyttömien (tai kalvovaurioisten) eliöiden DNA: ta, mutta ei kuulu elinkelpoisiin bakteereihin. Valoaktivaation jälkeen PMA sitoutuu kovalenttisesti DNA: han estäen sen vahvistumisen PCR: llä . Valoaltistuksen jälkeen sitoutumaton PMA ei kykene enää vuorovaikutukseen DNA-molekyylien kanssa.

määritys optimoitiin ensin haponopeilla bacilleilla (AFB)-negatiivisilla yskösnäytteillä, joihin oli lisätty kuolleita tai eläviä mykobakteereja eri pitoisuuksina. Lyhyesti sanottuna eläviä Mycobacterium fortuitum-soluja lisättiin N-asetyyli−kysteiinipuhdistettuihin yskösnäytteisiin, jotka olivat AFB-negatiivisia, smear-mikroskoopilla, jossa lopullinen pitoisuus oli 106 bakteeria·mL-1. Osa tästä laboratoriossa tehdystä näytteestä käsiteltiin M. fortuitumin solujen kuumentamiseksi. PMA-kantaliuos valmistettiin ja säilytettiin -20°C: ssa ja suojattiin valolta käyttöön asti valmistajien suositusten mukaisesti. PMA lisättiin esikäsittelynä lopullisena pitoisuutena 500 µM, ja sitä inkuboitiin 30 minuutin ajan 4°C: ssa pimeässä, minkä jälkeen se altistettiin siniselle LED-aktiiviselle valolle (GenIUL, Terrassa, Espanja) 15 minuutin ajan huoneenlämmössä. DNA erotettiin tavanomaisella fenolikloroformimenetelmällä. Valoaltistusvaiheen tehon arvioimiseksi M. fortuitum-viljelmästä erotettua paljasta DNA-näytettä käsiteltiin 500 µM: n PMA: lla, joka oli aiemmin altistettu LED-valolle 15 minuutin ajan. Tämän jälkeen tehtiin kaupallinen line-probe-määritys (genotyyppi® Mycobacterium CM; hain Lifescience, Nehren, Saksa) kliinisesti merkittävien mykobakteeri-lajien tunnistamiseksi . Näytteet, jotka sisältävät elävää M: ää. fortuitumin hybridisaatioprofiili oli normaali nitroselluloosanauhalla, kun taas bakteerien tappamiseksi käsitellyissä näytteissä ei havaittu vahvistusta lukuun ottamatta sisäistä kontrollia (tietoja ei näy). Koska valo-inaktivoidulla PMA: lla käsitellyllä paljaalla DNA: lla oli normaali hybridisaatioprofiili, valoaltistusvaihe oli tehokas eikä PMA: n jäännös enää estänyt PCR: ää.

optimoituamme protokollan kuolleista bakteereista johdetun DNA: n inaktivoimiseksi sovitimme sen Xpert® MTB / RIF-automaattiseen määritykseen (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA). Xpert® MTB/RIF: n reaaliaikainen PCR tarjoaa kynnysjaksoja (Ct), joiden avulla voidaan laskea monistustuoton ero sellaisten näytteiden välillä, joissa on tai ei ole käytetty PMA-esikäsittelyä (ΔCt): pieni ΔCt osoittaa elävistä bakteereista peräisin olevan vahvistettavan DNA: n läsnäolon, kun taas suuri ΔCt osoittaa, että näytteen kohde-DNA on peräisin kuolleista tai vaurioituneista bakteereista, ja siksi PMA-esikäsittely vaikuttaa merkittävästi sen monistumiseen. ΔCt-arvon laskemiseksi otimme huomioon kullekin Xpert® MTB/RIF-testiin sisältyvälle anturille annettujen Ct-arvojen keskiarvon (A-E).

testasimme PMA-protokollaa käyttäen Xpert® MTB/RIF-määritystä Afb-negatiivisten kliinisten näytteiden Ct-kalibrointikäyrällä, johon oli lisätty lämpökuolleita / eläviä mykobakteereja eri suhteissa. Korkea kuolleiden ja elävien solujen suhde aiheutti suurimman eron ΔCt-arvoissa lämpökäsiteltyjen ja elävien osien välillä PMA: lla, kun taas näytteitä, joissa oli yhtä suuri osuus kuolleita ja eläviä bakteereja, ei voitu erottaa toisistaan PMA: n esikäsittelyn avulla (tietoja ei näy). Samanlaisia tietoja ovat raportoineet Kralik et al. .

lopulta testasimme lähestymistapaa kliinisillä näytteillä. Ensimmäiseen validointitutkimukseen osallistui 10 potilasta, joilla diagnosoitiin aktiivinen keuhkotuberkuloosi (ysköspositiivinen ja viljelmä positiivinen). Näytteet kerättiin diagnoosin yhteydessä (t0) ja 10-20 hoitopäivän jälkeen (t1) N-asetyyli-kysteiini puhdistettiin ja käsiteltiin mgit-960-nesteviljelmää varten (Bd Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) kansainvälisten ohjeiden mukaisesti . Kaikki potilaat olivat edelleen AFB-positiivisia ysköksen smear-mikroskoopilla T1: ssä. Samanaikaisesti 250 µL dekontaminoituja näytteitä käsiteltiin molekyylianalyysia varten Xpert® MTB / RIF-määrityksellä sekä PMA-esikäsittelyllä että ilman sitä. Tämän jälkeen näytteet käsiteltiin valmistajan Xpert® MTB/RIF-määritystä koskevien ohjeiden mukaisesti.

kuten kuviosta 1 ilmenee, PMA ei vaikuttanut merkittävästi T0-pitoisuudella kerättyjen näytteiden PCR-saantoon (keskiarvo±sem ΔCt 2, 3±0, 5), kun taas T1-pitoisuudella hoidettujen näytteiden ΔCt-arvo oli PMA-hoidon jälkeen 10, 5±0, 9 (p=0, 0003), mikä vahvisti, että näiden näytteiden ysköspositiivisuus johtui enimmäkseen erittäin vaurioituneista bakteereista. Lisäksi PMA-käsittelemättömissä näytteissä t0: n ja t1: n välillä laskettu ΔCt oli liian pieni (ΔCt 2, 9±0, 9), jotta hoidon aiheuttama bakteerikuormitus olisi vähentynyt.

kahdella Xpert® – mittauksessa ”alhaiseksi” t0-arvoksi arvioidulla potilaalla viljelmä oli negatiivinen t1-arvossa, kun taas kaikki muut potilaat, joiden arvosana oli ”keskitasoinen” tai ”korkea”, pysyivät mgit-mittauksessa viljelmäpositiivisina. Vaikka tarkkaa aikaa positiivisuuteen ei voida arvioida, havaitsimme, että T1: ssä kerätyistä näytteistä saadut viljelmät muuttuivat positiivisiksi noin 7-10 päivää myöhemmin verrattuna T0: ssä kerätyistä näytteistä saatuihin viljelmiin, mikä viittaa elävän bakteerikuorman vakavaan vähenemiseen.

kaikki potilaat hoidettiin ja parannettiin onnistuneesti hoidon lopussa, ja tämä oli yhdenmukaista PMA-määrityksellä havaitun elävien bakteerien määrän vähenemisen kanssa.

negatiivisena kontrollina otimme taannehtivasti mukaan myös hoidon epäonnistumistapauksen (AFB-positiivinen ja culture-positiivinen 5 kuukauden standardihoidon jälkeen). Tässä tapauksessa PMA-esikäsittely sekä 1 kuukauden että kahden hoidon aikana kerätyillä puhdistetuilla yskösnäytteillä ei vaikuttanut merkittävästi PCR: n saantoon (ΔCt ∼2), mikä tuki TUBERKULOOSILÄÄKITYKSEN tehottomuutta.

saman protokollan olisi periaatteessa oltava yhteensopiva muiden CE-hyväksyttyjen molekyylitestien ja Maailman terveysjärjestön tuberkuloosin diagnosointia varten hyväksymien line probe-määritysten kanssa; lisätutkimuksia tarvitaan tämän mahdollisuuden poissulkemiseksi.

aiemmissa tutkimuksissa on osoitettu, että PMA: n avulla voidaan erottaa elävät ja kuolleet mykobakteerit 25-50 µM: n pitoisuudella. Tutkimussuunnitelmaa laadittaessa 100 µM: n lopullisella konsentraatiolla vältettiin täysin lämpökuolemasta M. fortuitumista peräisin olevan DNA: n monistuminen; havaittiin heikko tausta, joka johtui kuumakuolemasta M. tuberkuloosista saadun DNA: n monistumisesta (tietoja ei näy). Voimme spekuloida, että erilainen soluseinän koostumus vaikuttaa jotenkin PMA: n kykyyn tunkeutua vaurioituneisiin mykobakteereihin. Todellakin, Kralik et al. havaittu, että PMA: n aiheuttama signaalin väheneminen elävien ja kuolleiden Mycobacterium avium subsp: n välillä. paratuberkuloosia oli vähemmän kuin muilla bakteerilajeilla. Lisäksi, kun otetaan huomioon romun määrä, joka voisi mahdollisesti sitoa PMA-molekyylejä puhdistettuun sputtaan, nostimme lopullisen pitoisuuden 500 µM: iin. Lisätutkimukset, joissa arvioidaan eroja PMA-hoidon vaikutuksessa kantoihin, joilla on erilainen soluseinän koostumus (esim. Beijing-kannat) ja/tai sputassa, jolla on erilaiset ominaisuudet (esim. verta sisältävä yskös) voisi paremmin valaista tämän testin hyödyllisyyttä erilaisissa kliinisissä tilanteissa.

løvdalin ym.mukaan. pieni osa kuolleista tai vakavasti loukkaantuneista soluista ei pysty kasvamaan. Pieni määrä soluja, jotka ovat vakavasti loukkaantuneita mutta jotka eivät ole viljeltävissä, voi selittää, miksi t1: ssä kerätyissä näytteissä on edelleen positiivinen signaali PMA-esikäsittelystä huolimatta. PMA-esikäsittelyllä ei vältetä kuolleiden solujen pienen osuuden havaitsemista (väärä positiivinen elinkelpoisuusmäärityksessä): testi saattaa siis yliarvioida elinkelpoiset mykobakteerit. Kliinisestä näkökulmasta tämä olisi kuitenkin pieni virhe verrattuna riskiin (hyvin pieni tässä testissä) aliarvioida elinkelpoiset mykobakteerit.

aineistomme osoittavat ensimmäistä kertaa, että kvantitatiiviset molekyylitekniikat yhdistettynä PMA-menetelmään voisivat olla vaihtoehto suoralle mikroskopialle ja viljelylle varhaisen hoitovasteen seurannassa ja yksilöllisten hoitojen alustavassa arvioinnissa. Tämän määrityksen avulla hoidon tehoa voidaan arvioida aikaisemmin, mikä osoittaa, että elintärkeä mykobakteerien kuormitus on selvästi vähentynyt. Hoitovasteen puuttuminen voidaan kuitenkin nopeasti todeta myös testillä, joka mahdollistaa hoito-ohjelman muuttamisen ja rajoittaa infektion leviämistä ja resistenssin kehittymistä edelleen .