Frühe Überwachung der Tuberkulosebehandlung durch Xpert® MTB/RIF

An die Redaktion:

Fortschritte bei der Verbesserung der Laborkapazität für die Tuberkulose-Diagnose führten zur Entwicklung molekularer Assays, die heute herkömmliche Mikroskopie- und kulturbasierte Methoden in großem Maßstab ersetzen . Leider erkennen aktuelle molekulare Techniken sowohl lebende als auch tote Bakterien, und ein positives Ergebnis impliziert nicht die Lebensfähigkeit des Erregers. In der Tat kann DNA nach dem Bakterientod lange Zeit bestehen bleiben, und Nukleinsäure aus toten Bakterien ist gleichermaßen amplifizierbar. Daher sind molekulare Assays zur Behandlungsüberwachung und/oder zur Infektionskontrolle ungeeignet.

Wir berichten über einen innovativen Ansatz zur selektiven Amplifikation von DNA aus lebensfähigem Mycobacterium tuberculosis in klinischen Proben, der zur Überwachung der mykobakteriellen Belastung bei Lungen-TB-Patienten während der Anti-TB-Behandlung nützlich ist.

Das Protokoll basiert auf der Vorbehandlung von Proben mit Propidiummonoazid (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, USA), eine chemische Verbindung, die die DNA von nicht lebensfähigen (oder membrangeschädigten) Organismen interkalieren kann, aber von lebensfähigen Bakterien ausgeschlossen ist. Nach der Lichtaktivierung bindet PMA kovalent an die DNA und verhindert deren Amplifikation durch PCR . Nach Belichtung kann ungebundenes PMA nicht weiter mit DNA-Molekülen interagieren.

Der Assay wurde zunächst mit säurefesten Bazillen (AFB) -negativen Sputumproben optimiert, die mit toten oder lebenden Mykobakterien in verschiedenen Konzentrationen versetzt waren. Kurz gesagt, lebende Mycobacterium fortuitum-Zellen wurden N-Acetyl-Cystein−dekontaminierten Sputumproben, die für AFB negativ waren, durch Abstrichmikroskopie bei einer Endkonzentration von 106 Bakterien · ml-1 zugesetzt. Ein Aliquot dieser im Labor hergestellten Probe wurde behandelt, um die M. fortuitum-Zellen abzutöten. PMA-Stammlösung wurde hergestellt und bei -20 ° C gelagert und vor Lichteinwirkung geschützt, bis zur Verwendung, wie von den Herstellern empfohlen. PMA wurde als Vorbehandlung bei einer Endkonzentration von 500 µM zugegeben und 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubiert, gefolgt von einer Belichtung mit blauem Leuchtdioden (LED)-aktivem Licht (GenIUL, Terrassa, Spanien) für 15 min bei Raumtemperatur. DNA wurde dann unter Verwendung eines Standard-Phenolchloroform-Verfahrens extrahiert. Als Kontrolle zur Bewertung der Wirksamkeit des Belichtungsschritts wurde ein Aliquot nackter DNA, das aus einer M. fortuitum-Kultur extrahiert wurde, mit 500 µM PMA behandelt, das zuvor 15 min lang dem LED-Licht ausgesetzt war. Anschließend wurde der kommerzielle Line-Probe-Assay (GenoType® Mycobacterium CM; Hain Lifescience, Nehren, Deutschland) durchgeführt, um klinisch relevante mykobakterielle Spezies zu identifizieren. Proben mit lebenden M. fortuitum zeigte ein normales Hybridisierungsprofil auf einem Nitrozellulosestreifen, während Proben, die zur Abtötung von Bakterien behandelt wurden, keine Amplifikation zeigten, mit Ausnahme der internen Kontrolle (Daten nicht gezeigt). Da mit Licht-inaktiviertem PMA behandelte nackte DNA ein normales Hybridisierungsprofil zeigte, war der Belichtungsschritt effizient und die PCR wurde durch restliches PMA nicht weiter gehemmt.

Nachdem wir das Protokoll für die Inaktivierung von DNA aus toten Bakterien optimiert hatten, passten wir es an den automatisierten Xpert® MTB/RIF-Assay (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA) an. Die mit dem Xpert® MTB / RIF durchgeführte Real-Time-PCR liefert Schwellenzyklen (Ct), mit denen die Differenz der Amplifikationsausbeute zwischen Proben mit und ohne PMA-Vorbehandlung (ΔCt) berechnet werden kann: Eine niedrige ΔCt zeigt das Vorhandensein amplifizierbarer DNA von lebenden Bakterien an, während eine hohe ΔCt anzeigt, dass die Ziel-DNA in der Probe von toten oder beschädigten Bakterien stammt und daher die PMA-Vorbehandlung ihre Amplifikation signifikant beeinflusst. Um den ΔCt-Wert zu berechnen, haben wir den Mittelwert zwischen den Ct-Werten für jede Sonde im Xpert® MTB / RIF-Test (A bis E) berücksichtigt.

Wir testeten das PMA-Protokoll mit dem Xpert® MTB / RIF-Assay an einer Ct-Kalibrierungskurve von AFB-negativen klinischen Proben mit hitzeabtötenden / lebenden Mykobakterien, die in verschiedenen Verhältnissen zugegeben wurden. Hohe Tot-Lebend-Verhältnisse führten zu einer maximalen Differenz der ΔCt-Werte zwischen wärmebehandelten und lebenden Anteilen mit PMA, während Proben, die einen ähnlichen Prozentsatz an abgetöteten und lebenden Bakterien enthielten, durch die Verwendung einer PMA-Vorbehandlung nicht voneinander unterschieden werden konnten (Daten nicht dargestellt). Ähnliche Daten wurden von Kralik et al. .

Schließlich haben wir den Ansatz an klinischen Proben getestet. 10 Patienten, bei denen eine aktive Lungentuberkulose diagnostiziert wurde (Sputumabstrich positiv und Kultur positiv), wurden in die erste Validierungsstudie aufgenommen. Proben wurden zum Zeitpunkt der Diagnose (t0) und nach 10-20 Tagen Therapie (t1) entnommen, N-Acetyl-Cystein dekontaminiert und für MGIT-960 liquid culture (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) nach internationalen Richtlinien verarbeitet . Alle Patienten waren noch AFB-positiv durch Sputumabstrichmikroskopie bei t1. Parallel dazu wurden 250 µL dekontaminierte Proben für die molekulare Analyse mittels Xpert® MTB/RIF Assay mit und ohne PMA-Vorbehandlung aufbereitet. Die Proben wurden dann gemäß den Anweisungen des Herstellers für den Xpert® MTB / RIF-Assay verarbeitet.

Wie in Abbildung 1 gezeigt, hatte PMA keinen signifikanten Einfluss auf die PCR-Ausbeute von Proben, die bei t0 gesammelt wurden (Mittelwert ± sem ΔCt 2,3 ± 0,5), während Proben, die während der Therapie bei t1 gesammelt wurden, ein ΔCt von 10,5 ± 0,9 zeigten nach der PMA-Behandlung (p = 0,0003), was bestätigt, dass die Sputumabstrichpositivität dieser Proben hauptsächlich auf stark geschädigte Bakterien zurückzuführen war. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass ΔCt, berechnet zwischen t0 und t1 in PMA-unbehandelten Proben, zu niedrig war (ΔCt 2,9 ± 0,9), um eine echte Abnahme der Bakterienlast aufgrund der Therapie zu schätzen.

Zwei Patienten, die vom Xpert® mit „niedrig“ bei t0 bewertet wurden, zeigten eine negative Kultur bei t1, während alle anderen Patienten, die mit „mittel“ oder „hoch“ bewertet wurden, von MGIT kulturpositiv blieben. Obwohl eine genaue Zeit bis zur Positivität nicht beurteilt werden kann, beobachteten wir, dass Kulturen aus Proben, die bei t1 gesammelt wurden, etwa 7-10 Tage später im Vergleich zu Kulturen aus Proben, die bei t0 gesammelt wurden, positiv wurden, was auf eine starke Verringerung der lebenden Bakterienlast hindeutet.

Alle Patienten wurden am Ende der Therapie erfolgreich behandelt und geheilt, und dies stand im Einklang mit der Reduktion lebender Bakterien, die durch den PMA-Assay nachgewiesen wurden.

Als Negativkontrolle haben wir retrospektiv auch einen Behandlungsversagensfall (AFB positiv und Kultur positiv nach 5 Monaten Standardbehandlung) aufgenommen. In diesem Fall hatte die PMA-Vorbehandlung beider dekontaminierten Sputumproben, die nach 1 Monat und zwei während der Behandlung gesammelt wurden, keinen signifikanten Einfluss auf die PCR-Ausbeute (ΔCt ∼2), was die Ineffizienz der Anti-TB-Behandlung unterstützte.

Das gleiche Protokoll sollte grundsätzlich mit anderen CE-zugelassenen molekularen Tests und Liniensonden-Assays kompatibel sein, die von der Weltgesundheitsorganisation für die Diagnose von TB gebilligt wurden; Weitere Studien sind erforderlich, um diese Möglichkeit auszuschließen.

Frühere Studien haben die Möglichkeit gezeigt, mit PMA zwischen lebenden und toten Mykobakterien mit einer Konzentration von 25-50 µM zu unterscheiden. Während des Protokollaufbaus wurde bei einer Endkonzentration von 100 µM eine Amplifikation von DNA, die von hitzetötetem M. fortuitum stammt, vollständig vermieden; Ein schwacher Hintergrund aufgrund der Amplifikation von DNA aus hitzetötetem M. tuberculosis wurde beobachtet (Daten nicht gezeigt). Wir können spekulieren, dass die unterschiedliche Zellwandzusammensetzung die Fähigkeit von PMA, beschädigte Mykobakterien zu durchdringen, irgendwie beeinflusst. In der Tat, Kralik et al. beobachtet, dass die PMA-induzierte Signalreduktion zwischen lebendem und totem Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis waren niedriger im Vergleich zu denen für andere Bakterienarten gefunden. In Anbetracht der Menge an Trümmern, die möglicherweise PMA-Moleküle in dekontaminierten Sputa binden könnten, erhöhten wir die Endkonzentration auf 500 µM. Weitere Studien zur Bewertung von Unterschieden der PMA-Behandlungswirkung bei Stämmen mit unterschiedlicher Zellwandzusammensetzung (z.B. Beijing-Stämme) und/oder bei Sputa mit unterschiedlichen Eigenschaften (z.B. b. bluthaltiges Sputum) könnte die Nützlichkeit dieses Tests in verschiedenen klinischen Umgebungen besser aufklären.

Nach LØvdal et al. Ein kleiner Teil der Zellen, von denen angenommen wird, dass sie tot oder schwer verletzt sind, kann nicht wachsen. Das Vorhandensein einer kleinen Anzahl von Zellen, die schwer verletzt, aber nicht kultivierbar sind, könnte erklären, warum wir trotz der PMA-Vorbehandlung immer noch ein positives Signal in Proben haben, die bei t1 gesammelt wurden. Die PMA-Vorbehandlung vermeidet nicht den Nachweis eines kleinen Anteils toter Zellen (falsch positiv für einen Lebensfähigkeitstest): der Test könnte daher lebensfähige Mykobakterien überschätzen. Aus klinischer Sicht wäre dies jedoch ein geringfügiger Fehler im Vergleich zu dem (für diesen Test sehr geringen) Risiko, lebensfähige Mykobakterien zu unterschätzen.Unsere Daten zeigen zum ersten Mal, dass quantitative molekulare Techniken in Kombination mit der PMA-Methode eine Alternative zur direkten Mikroskopie und Kultur zur Überwachung des frühen Ansprechens auf die Behandlung und zur vorläufigen Bewertung personalisierter Therapien darstellen könnten. Die Verwendung dieses Assays kann eine frühere Bewertung der Wirksamkeit der Behandlung ermöglichen und eine deutliche Abnahme der vitalen Mykobakterienbelastung zeigen. Das Ausbleiben des Ansprechens auf die Therapie kann jedoch auch durch den Test sofort erkannt werden, was eine Änderung des Behandlungsschemas ermöglicht und die Ausbreitung der Infektion und die weitere Resistenzentwicklung begrenzt .

• 2. JANUAR 2012