Juli 6, 2021

Lithiumchlorid tötet den Honigbienenparasiten Varroa destructor durch systemische Wirkungsweise wirksam ab

Pilotstudie: Von RNAi zu Lithiumchlorid

In einer Pilotstudie wurden von Milben befallene Honigbienen eingesperrt und mit Saccharosesirup gefüttert, der dsRNAs potenziell essentieller Varroa-Gene enthielt (Ergänzende Tabelle S1). Als Kontrollen dienten reiner Saccharosesirup (unbehandelt) und Sirup mit dsRNA basierend auf der kodierenden Sequenz für das grün fluoreszierende Protein GFP (dsGFP ctrl). GFP wird in der biolumineszierenden Hydrozoenqualle Aequorea victoria exprimiert. Die GFP-Sequenz wurde als Kontrolle gewählt, da im Genom von Honigbienen oder der Varroamilbe kein homologes Gen existiert. In der unbehandelten Gruppe betrug die Milbensterblichkeit <5%. Im Gegensatz dazu wurden alle Milben an Bienen, die eine Saccharoselösung mit dsRNA erhielten, die auf Varroa-Gene abzielte, innerhalb von drei Tagen effektiv abgetötet. Eine identische Wirkung auf Milben wurde jedoch in einem Kontrollexperiment beobachtet, in dem Bienen mit GFP-dsRNA gefüttert wurden (Ergänzende Abb. S1). Diese Ergebnisse schlossen den vorgeschlagenen RNAi-vermittelten Mechanismus aus, deuteten jedoch entweder auf eine noch unbekannte Wirkung von RNA oder auf die Aktivität anderer Komponenten in der Testlösung hin. Da bei der Herstellung von dsRNAs hohe Konzentrationen an Lithiumchlorid (LiCl) verwendet und daher zusammen mit der dsRNA an die Bienen verfüttert wurden, haben wir uns entschieden, LiCl in Saccharoselösung an Käfigbienen zu verfüttern, um seine Aktivität gegen Varroamilben zu testen. Auffallend ist, dass LiCl in Konzentrationen von 25 mM, was der berechneten Konzentration in der dsRNA-Lösung entspricht, die Milben genauso effektiv tötete wie die dsRNA-haltigen Testsubstanzen. Darüber hinaus wurde nach weitgehender Entfernung von LiCl aus dsRNA durch ausgiebiges Waschen (gewaschene dsGFP ctrl) die mitizide Aktivität wesentlich vermindert, wie durch verzögerten Beginn und verminderte Aktivität angezeigt (Ergänzende Fig. S1). Aus diesen Daten schlossen wir, dass LiCl, nicht RNA Knockdown, die beobachtete Aktivität auf Varroamilben vermittelte und dass es sich lohnen würde, das Potenzial von LiCl als Varroazid zu analysieren.

Effektive Konzentration von Lithiumchlorid

Um die primären Beobachtungen unserer Pilotstudie zu bestätigen, haben wir Käfigexperimente mit unterschiedlichen Konzentrationen von LiCl für eine robuste statistische Analyse durchgeführt. Zusätzlich zu der Konzentration von 25 mM, die in der Pilotstudie als wirksam befunden wurde, verwendeten wir Konzentrationen von 2 mM, 4 mM und 10 mM, um die untere Wirksamkeitsschwelle zu bestimmen. Die Ergebnisse stützten die Ergebnisse der vorangegangenen Studie und zeigten signifikante mitizide Wirkungen für LiCl-Konzentrationen ab 2 mM, bei denen ein signifikanter Anstieg der Milbensterblichkeit (P < 0,001, Log-Rank-Test; Ergänzende Tabelle S2) gezeigt wurde. Höhere Konzentrationen von 10 mM und 25 mM erhöhten beide signifikant die Milbensterblichkeit ab dem zweiten Behandlungstag und erreichten am Ende des Experiments die Ausrottung von mehr als 96% der behandelten Milben (Abb. 1a, ergänzende Tabelle S2). In den Kontrollversuchen ohne LiCl in der Fütterungslösung erreichte die Milbensterblichkeit im Durchschnitt 9,3% und lag damit deutlich im Bereich der Sterblichkeitsraten, die für Milben erzielt wurden, die an unbehandelten Käfigbienen unter verschiedenen Umweltbedingungen gehalten wurden33. Basierend auf diesen Ergebnissen bestätigten wir einen klaren Effekt von LiCl auf die Milbenlebensfähigkeit in einem Konzentrationsbereich zwischen 2 mM und 25 mM.

In diesen Experimenten wurden die Käfigbienen über mehrere Tage mit der jeweiligen Konzentration an LiCl gefüttert, bis alle Milben durch die Behandlung abgetötet waren. Für eine mögliche Verwendung in der Bienenzuchtpraxis wäre jedoch eine kürzere und definierte Behandlungsdauer vorzuziehen. Wir führten daher ein zusätzliches Experiment durch, bei dem die effektivste Konzentration von 25 mM LiCl (Abb. 1a) wurde für 24 h verabreicht, gefolgt von einer Fütterung mit Zuckerlösung für weitere sechs Tage. Am Ende des Beobachtungszeitraums, 92.9% der Milben (n = 225 Milben, P < 0.001, Log-Rank-Test) wurden ohne signifikante Wirkung auf die behandelten Bienen abgetötet (siehe nächster Absatz). Dieses Ergebnis zeigt deutlich, dass bereits eine kurzfristige Fütterung von 25 mM LiCl ausreicht, um die Milbenpopulation deutlich zu verringern.

Um die von den Bienen aufgenommene Menge an LiCl genau zu bestimmen, die notwendig ist, um parasitierende Milben abzutöten, wurden 12 frisch geschlüpfte Bienen künstlich mit 10 µl LiCl-Lösungen von 4 mm bis 100 mm gefüttert und einzeln mit einer phoretischen Milbe für fünf Tage in Käfigen gehalten. Bei den 4 mM und 10 mM Lösungen, die einer Aufnahme von 1,7 µg bzw. 4,2 µg LiCl entsprachen, unterschied sich der Effekt nicht signifikant von der unbehandelten Kontrolle (n = 12 Milben, P = 1.000, Log-Rank-Test, Ergänzende Tabelle S3). Eine Einzeldosis von 25 mm, entsprechend 10,6 µg LiCl, die von der Biene verbraucht wurde, reichte jedoch aus, um 100% der phoretischen Milben innerhalb von 48 Stunden abzutöten (Abb. 2).

Wirkung auf Arbeitsbienen

Zur Analyse der Verträglichkeit von LiCl gegenüber Arbeitsbienen wurden die Testkäfige, die zur Analyse der Milbensterblichkeit verwendet wurden (Abb. 1a) wurden zusätzlich für die Sterblichkeit der Arbeitsbienen erfasst. Nach Exposition mit 2 mM, 10 mM und 25 mM LiCl, die nachweislich eine mitizide Wirkung entfalten, lag die Mortalität der behandelten Arbeitsbienen innerhalb der verschiedenen Fütterungsgruppen im Durchschnitt zwischen 3 und 7%. Mit Ausnahme der 10 mM LiCl-Gruppe (n = 12 Käfige, P = 0,015, Log-Rank-Test; Ergänzende Tabelle S4) unterschieden sich die Werte nicht signifikant von der 4%-Mortalität in der unbehandelten Kontrollgruppe. Darüber hinaus lagen die Mortalitätsraten unserer Kontrollen deutlich im Bereich der Mortalität von unbehandelten Käfigbienen, die als Kontrolle in toxikologischen Tests erforderlich ist34, was die Gültigkeit unseres Testsystems bestätigt. Auch die 24-h-Behandlung mit LiCl hatte keinen Einfluss auf die Mortalität der Arbeitsbienen (Abb. 1b; n = 9 Käfige, P = 0,308, Log-Rank-Test). Eine gute Verträglichkeit von LiCl gegenüber Bienen wurde auch durch die Fütterung einer Einzeldosis bestätigt (Milbensterblichkeit siehe Abb. 2), die keinen signifikanten Anstieg der Arbeiterbienensterblichkeit hervorriefen (P = 1.000, Log-Rank-Test; Ergänzende Tabelle S5).

Als nächstes wurden verschiedene Konzentrationen von LiCl kontinuierlich gefüttert, bis die letzte Käfigbiene starb, um die Reaktion auf eine Langzeitexposition zu untersuchen. Hier reduzierte die Behandlung die durchschnittliche Lebensdauer frisch geschlüpfter Arbeitsbienen signifikant von 26 Tagen in den unbehandelten Kontrollkäfigen auf 23 bzw. 22 Tage für 2 mM bzw. 10 mM LiCl (n = 60 Bienen, P = 0,024, Log-Rank-Test; Ergänzende Tabelle S6). Bei Bienen, die die höchste Konzentration von 25 mM LiCl erhielten, reduzierte sich die Lebensdauer signifikant auf durchschnittlich 19 Tage (Abb. 3a).

LiCl scheint jedoch die Lebensfähigkeit der Bienen nur dann zu beeinträchtigen, wenn es über einen längeren Zeitraum verabreicht wird, wie ein zusätzliches Experiment zeigt, bei dem LiCl die ersten 24 h nach dem Schlüpfen gefüttert und dann durch Saccharosesirup ersetzt wurde, bis die letzte eingesperrte Biene starb (Abb. 3b). Hier lag die durchschnittliche Lebensdauer frisch geschlüpfter Arbeitsbienen zwischen 22 Tagen (10 mM) und 24 Tagen (Kontrolle) ohne signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen (n = 120 Bienen pro Behandlung, P ≥ 0,126, Log-Rank-Test; Ergänzende Tabelle S7). Basierend auf diesen Daten von Käfigbienen schließen wir, dass bereits eine kurzfristige LiCl-Behandlung ausreicht, um den Varroamilbenbefall vollständig auszurotten, ohne dass die Lebensfähigkeit der Arbeitsbienen beeinträchtigt wird. Diese in Käfigversuchen unter kontrollierten Bedingungen erzielten Ergebnisse stellen einen erfolgreichen und vielversprechenden ersten Schritt zu einem neuen Ansatz zur Varroabehandlung dar. Effizienz und Nebenwirkungen müssen jedoch unter Feldbedingungen bestätigt werden.

Feldversuche mit Lithiumchlorid in künstlichen Schwärmen

Um die Feldbedingungen anzunähern, testeten wir 25 mM und 50 mM LiCl in neun brutfreien künstlichen Schwärmen, bestehend aus jeweils einer Königin und etwa 20.000 Bienen. Diese Konzentrationen wurden basierend auf früheren Experimenten mit Käfigbienen unter Verwendung der höchsten Dosis ausgewählt, die von Bienen in kurzen Applikationszeiten (25 mM) noch toleriert wurde. Da eine gleichmäßige Verteilung des Saccharosesirups über den gesamten künstlichen Schwarm von etwa 20.000 Bienen schwierig gewesen sein könnte, testeten wir zusätzlich eine 50-mM-Konzentration von LiCl, um sicherzustellen, dass jede Biene ausreichend Lithium ausgesetzt war. Dementsprechend wurden die Schwärme ad libitum mit Saccharosesirup mit 25 mM LiCl (n = 6) oder 50 mM (n = 3) über einen Zeitraum von drei Tagen gefüttert, gefolgt von einer topischen Anwendung von Perizin®. Perizin®, das das Organophosphat Coumaphos als Wirkstoff enthält, ist ein hochwirksames Varroazid, das häufig als Kontrollbehandlung35 verwendet wird. Die Milbensterblichkeit wurde über einen Zeitraum von fünf Tagen überwacht. Vor der Kontrollbehandlung tötete 25 mM LiCl etwa 90% der in den künstlichen Schwärmen vorhandenen Milben ab (Tabelle 1). Die höher konzentrierte Lösung (50 mM) verstärkte diesen Effekt jedoch nicht (χ2-Test, P = 0,953). Insgesamt war die Wirksamkeit im Vergleich zu den Cage-Tests etwas geringer. Eine Erklärung könnte sein, dass die Verteilung von LiCl innerhalb einer Gruppe von Tausenden von Bienen mehr Zeit benötigt, bis die letzte einzelne Biene eine ausreichende Dosis verbraucht, um die jeweilige parasitierende Milbe abzutöten. Die notwendige Fütterungszeit solch riesiger Einheiten von 20.000 Bienen und mehr muss in weiteren Experimenten analysiert werden.

Tabelle 1 Vergleich der varroaziden Wirkung von zwei Lithiumchlorid-Diäten, die künstlichen Schwärmen fünf Tage lang verabreicht wurden.

Wirksamkeit anderer Lithiumverbindungen und Nicht-Lithiumsalze

Um Lithium als aktive Komponente für die Wirkung auf Varroamilben zu bestätigen, haben wir eine Reihe von Lithiumverbindungen getestet und die mitiziden Wirkungen mit nicht-Lithiumsalzen verglichen. Von besonderem Interesse waren Lithiumcitrat, eine Verbindung mit drei Lithiumionen, Lithiumsulfat und Lithiumcarbonat, die zwei Lithiumionen im Vergleich zu nur einem Lithiumion in LiCl aufweisen. Zusätzliche Verbindungen mit einem Lithiumion (Lithiumlactat, Lithiumacetat), aber unterschiedlicher Löslichkeit, chemischer Reaktivität und Preis wurden einbezogen, um die Wirksamkeit und Verträglichkeit im Vergleich zu LiCl zu analysieren. In Käfigversuchen eliminierten alle Verbindungen 100% der Milben bei 25 mm innerhalb von drei (Lithiumcitrat und Lithiumacetat) bis vier Tagen (Lithiumsulfat, Lithiumlactat und Lithiumcarbonat). Auch die 4-mM-Testlösungen töteten phoretische Milben innerhalb von fünf (Lithiumcitrat, Lithiumsulfat und Lithiumacetat) bis sieben Tagen (Lithiumlactat) mit Ausnahme von Lithiumcarbonat vollständig ab (Tabelle 2; Ergänzende Tabelle S8).

Tabelle 2 Mortalität von phoretischen Varroamilben und Arbeiterbienen nach Fütterung von zwei Konzentrationen verschiedener Lithiumverbindungen über einen maximalen Fütterungszeitraum von sieben Tagen.

Die Sterblichkeit der Arbeiterbienen war bei beiden Konzentrationen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollbienen nicht signifikant erhöht, mit Ausnahme von 25 mM Lithiumsulfat und 25 mM Lithiumlactat (ergänzende Tabelle S9). Mit diesen Experimenten konnten wir bestätigen, dass andere Lithiumverbindungen ein ähnliches Potenzial für die Verwendung als systemisches Akarizid haben. Dies könnte die Flexibilität für die mögliche Gestaltung eines Tierarzneimittels erhöhen. In Anbetracht des Preises sind Lithiumchlorid und Lithiumcitrat die billigsten Verbindungen. Lithiumsulfat ist aufgrund der geringeren Bienenverträglichkeit weniger geeignet und Lithiumcarbonat aufgrund einer relativ geringen Wasserlöslichkeit.

Um die konzentrationsabhängige Wirksamkeit von Lithiumverbindungen genauer zu untersuchen, verglichen wir LiCl mit Lithiumcitrat (Li3C6H5O7), das den größten Unterschied in der Anzahl der Lithiumionen pro Molekül aufwies, bei fünf verschiedenen Konzentrationen in einem Bereich von 1 mM-25 mM. Alle Konzentrationen von Lithiumcitrat zeigten im Vergleich zu LiCl eine signifikant höhere akarizide Aktivität, es gab jedoch keinen Unterschied in der Mortalität der Bienen (Tabelle 3, Ergänzende Tabellen S9 und S11). Daher könnte Lithiumcitrat einen noch besseren Wirkstoff darstellen.

Tabelle 3 Vergleich der Wirksamkeit und Nebenwirkungen von LiCl und Lithiumcitrat mit Konzentrationen von 1 mM bis 25 mM über einen maximalen Fütterungszeitraum von sieben Tagen.

Als lithiumfreie Kontrolle und zum Ausschluss von Chlorid als Wirkstoff testeten wir auch die Alkalisalze Natriumchlorid (NaCl) und Kaliumchlorid (KCl) sowie Magnesiumchlorid (MgCl) bei 25 mM. Wir beobachteten keine varroazide Wirkung für NaCl oder KCl (n = 30, P = 1.000, Log-Rank-Test, Ergänzende Tabelle S12). In Tests mit MgCl starben 100% der Käfigbienen innerhalb von fünf Tagen (P < 0.001, log-Rank-Test), und entsprechend der rückläufigen Anzahl von Bienen wurde das Experiment abgebrochen, bevor die Wirkung auf Milben analysiert werden konnte. Basierend auf diesen Experimenten schlossen wir, dass Lithium tatsächlich dosisabhängig akarizide Aktivität vermittelt und dass Lithiumcitrat die günstigsten Eigenschaften aller bisher getesteten Verbindungen aufweist.

Potenzial von Lithiumverbindungen als neues Varroazid

Wir haben gezeigt, dass nicht die ursprünglich hypothetischen doppelsträngigen RNAs gegen essentielle Varroa-Gene, sondern überraschenderweise Lithiumsalze eine starke akarizide Wirkung auf Varroamilben an Käfigbienen und in künstlichen Schwärmen vermitteln. Diese Ergebnisse zeigen somit, dass Lithiumverbindungen eine neue Klasse von akariziden Wirkstoffen mit einem hervorragenden Potenzial und einer bemerkenswert guten Verträglichkeit für Bienen darstellen. Die unterschiedliche Empfindlichkeit von Milben und Bienen gegenüber LiCl ist umso bemerkenswerter, als aufgrund von Verdünnungseffekten die Konzentration von LiCl in der Hämolymphe der Bienen wahrscheinlich wesentlich niedriger sein wird als die Konzentration, die den Bienen zugeführt wird.

Wichtig ist, dass unsere Ergebnisse nicht implizieren, dass akarizide Wirkungen von RNAi-basierten Ansätzen, wie von Garbian et al.32 werden im Allgemeinen durch LiCl vermittelt. Nach der Fütterung einer Mischung von dsRNA an Honigbienen über einen Zeitraum von 60 Tagen haben Garbian et al.32 verzeichneten einen langsamen Anstieg der Milbensterblichkeit mit einer endgültigen Behandlungswirksamkeit von nur 60%. Angesichts der schnellen und hochwirksamen Reaktion unserer künstlichen Schwärme auf Behandlungen mit LiCl sind unterschiedliche Wirkweisen wahrscheinlich: Während RNAi-vermittelte Effekte Langzeiteffekte zu entfalten scheinen, stellen Lithiumverbindungen einen unabhängigen Mechanismus mit schnell einsetzender und hoher Wirksamkeit dar.

Als Varroazid weist LiCl einige Merkmale auf, die in dieser Kombination einzigartig sind: (i) LiCl wirkt systemisch über die Honigbienenfütterung („easy-to-apply“), (ii) es ist wasserlöslich und reichert sich daher nicht im Bienenwachs an, was ein entscheidendes Problem für Langzeitbehandlungskonzepte mit synthetischen Varroaziden mit lipophilen Eigenschaften ist36,37 (iii) Die orale Toxizität der meisten Lithiumverbindungen für Säugetiere ist relativ gering38 (iv) es hat keine abweisende Wirkung auf die Fütterungslösung im relevanten Konzentrationsbereich von 2-25 mM39 und (v) es ist zu moderaten Preisen erhältlich. Sehr vielversprechend ist die Tatsache, dass eine einmalige Anwendung von nur 10 µl LiCl in einer 25 mM Lösung (entsprechend einer Dosierung von 10,6 µg LiCl) pro Einzelbiene ausreicht, um phoretische Milben abzutöten. Eine Herausforderung für die weitere Forschung wird die Entwicklung einer intelligenten Applikationstechnik für Schwärme und Kolonien in voller Größe sein, um sicherzustellen, dass alle Bienen die kritische Menge des Wirkstoffs erhalten.

Derzeit wissen wir nicht, wie LiCl die phoretischen Varroamilben abtötet, und es gibt nur wenige Veröffentlichungen über die Wirkung von LiCl bei Insekten40. In der Humanmedizin wird Lithium seit den 1870er Jahren verwendet und ist ein stimmungsstabilisierendes Mittel zur Behandlung manischer Episoden und zur Erhaltungstherapie bipolarer Störungen41. Im Hinblick auf ihre therapeutische Verwendung wurden Lithiumverbindungen und ihr Toxizitätsprofil sorgfältig untersucht. Bisher wurden eine Reihe von Enzymen, die auf den Stoffwechsel, die Entwicklung, die Hämatopoese und andere Prozesse einwirken, als potenzielle Ziele vorgeschlagen42,43. Diese Enzyme benötigen Metallionen und Lithium übt seine Aktivität auf nicht wettbewerbsfähige Weise aus, was höchstwahrscheinlich durch Verdrängung eines zweiwertigen Kations geschieht. Zugegebenermaßen haben wir derzeit keinen Hinweis darauf, dass die beobachtete mitizide Wirkung von Lithiumverbindungen auf einer vergleichbaren Wirkungsweise beruht.

Wir sind uns auch der Tatsache bewusst, dass unsere Ergebnisse nur den ersten Schritt zur Entwicklung eines neuen Tierarzneimittels darstellen. Feldversuche in freifliegenden Kolonien sind ebenso notwendig wie die Analyse von subletalen und langfristigen Nebenwirkungen auf adulte Bienen und Honigbienenbrut und mögliche Rückstandsprobleme im Honig.

Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten jedoch bereits darauf hin, dass LiCl Potenzial als wirksame und einfach anzuwendende Behandlung für künstliche und natürliche Schwärme und insbesondere für die große Anzahl von Paketbienen hat, die in den Vereinigten Staaten zur Bestäubung eingesetzt werden11,44. Darüber hinaus könnte die Aufklärung des Wirkmechanismus neue Wege für die gezielte Entwicklung von Tierarzneimitteln zur Bekämpfung von Varroamilben eröffnen.