MRSA-Nachweis

Nachweis und Identifizierung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA)

Schlüsselpunkte

• Gram +ve coccus
• Traubenartige Zellcluster
• Resistent gegen Methicillin und andere Penicilline
• Kann auch als ORSA bezeichnet werden

Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) wurden erstmals in den frühen 1960er Jahren gemeldet und gelten heute weltweit als ein im Krankenhaus erworbener Erreger. Der Begriff Methicillin-resistent wird historisch verwendet, um die Resistenz gegen eine dieser Klassen von antimikrobiellen Mitteln zu beschreiben. Heute in den USA ca. 35% der Krankenhausstämme von S. aureus sind resistent gegen Methicillin (oder andere Penicillin-Antibiotika), und in den letzten Jahren hat das Auftreten von Vancomycin-resistentem S. aureus (VRSA) zusätzliche Besorgnis ausgelöst.Resistenz tritt auf, wenn der Organismus ein mecA-Gen hat, das ein verändertes Penicillin-Bindungsprotein, PBP2a (auch bekannt als PBP2′), und entweder eine Oxacillin-MHK von 2 mg / l oder eine Methicillin-MHK von 4 mg / l produziert.Infizierte und kolonisierte Patienten sind das Reservoir von MRSA sowohl in Krankenhäusern als auch in der Gemeinschaft, wobei die Übertragung im Allgemeinen über den Kontakt mit Gesundheitspersonal erfolgt.Effektive, schnelle Labordiagnostik und Empfindlichkeitstests sind entscheidend für die Behandlung, das Management und die Prävention von MRSA-Infektionen.

Detektionstechniken

Das Labor-Screening auf MRSA ist ein komplexes Gleichgewicht zwischen Ergebnisgeschwindigkeit, Sensitivität, Spezifität und Kosten.

Derzeit wird der Großteil des Screenings mit plattenbasierten Methoden durchgeführt. Umfragen deuten darauf hin, dass diese Methodengruppe >90% der durchgeführten Screening-Tests ausmacht.

Eine Reihe alternativer Methoden, einschließlich Bouillon-basierter Methoden, chromogener Medien, Schnellscreening-Kits, molekularer Assays und automatisierter Systeme, werden jedoch zunehmend eingesetzt. Die Isolierung von Screening-Tupfern kann aufgrund der Anzahl kontaminierender Organismen, die in Tupfern von nicht sterilen Stellen vorhanden sind, ein langwieriger Vorgang sein.

Bouillon-basierte Anreicherungsmedien werden üblicherweise eingesetzt, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Dies geht jedoch zu Lasten der Geschwindigkeit des Ergebnisses. NaCl wird im Allgemeinen zusammen mit Methicillin, Oxacillin oder Cefoxitin zu der Basisbrühe gegeben. Indikatorverbindungen können auch verwendet werden, um einen frühen Hinweis auf das Vorhandensein von MRSA zu geben.

Feste Agarmedien: Es gibt keine allgemeingültigen standardisierten Methoden für das Screening und die Isolierung von MRSA mit festen Agarmedien. Viele selektive Medien sind verfügbar, und diese verlassen sich auf Inhibitoren wie NaCl und / oder Antibiotika, um die Auswahl zu unterstützen, zusammen mit einem pH-Indikator, um Vermutungen hervorzuheben. Beispiele sind Mannitsalz-Agar, der 7% NaCl mit entweder 4 mg / l Methicillin oder 2 mg / l Oxacillin enthält; Oxacillin-resistenter Screening-Agar mit 5,5% NaCl und 2 mg / l Oxacillin; Baird Parker Medium mit 8 mg / l Ciprofloxacin; Mueller Hinton Agar mit 4% NaCl und 6 mg / l Oxacillin. Die Empfindlichkeit bei einer Inkubation von 24 Stunden ist variabel, wobei für ein akzeptables Ergebnis häufig eine Inkubation von 48 Stunden erforderlich ist.Kürzlich entwickelte chromogene Medien kombinieren primäres Wachstum und Selektivität mit Differenzierung von Koagulase-negativen Staphylokokken. Diese Medien zeigen im Vergleich zu herkömmlichen Medien eine verbesserte Spezifität. Die Empfindlichkeit ist ebenfalls verbessert, erfordert jedoch 48 Stunden Inkubation, um >85% zu erreichen.

Die Mehrheit der molekularen Methoden zum Nachweis von MRSA sind in-house, die sich auf Multiplex-PCR-Primer detektieren Gene spezifisch für S. aureus (nuc, fem) und mecA Nachweis von Methicillin-Resistenz. Die meisten sind aufgrund des Vorhandenseins von Koagulase-negativen Staphylokokken, die das Methicillin-resistente Gen mecA tragen, nur für die Verwendung mit Reinkulturen und nicht für das Screening von Tupfern geeignet. Neuere kommerziell erhältliche Amplifikationstests, die auf mecA in Kombination mit anderen spezifischen Markern wie Koagulase abzielen und ermutigende Ergebnisse gezeigt haben

Es gab eine Reihe von Entwicklungen mit Biolumineszenz, insbesondere die Verwendung von Adenylatkinase (AK), einem Enzym, das in allen Zellen vorkommt, die ATP aus ADP produzieren. Die AK-Messung ist empfindlicher als ATP-basierte Systeme und ermöglicht den routinemäßigen Nachweis von 50 oder mehr Organismen in einer Probe. Frühe Leistungsdaten zeigen Ergebnisse, die herkömmlichen Plattenkulturmethoden entsprechen, und liefern Ergebnisse innerhalb von 5 Stunden.

Identifizierung/Bestätigung

Traditionell wird die Bestätigung von S. aureus mit dem Objektträger-Koagulase-Test (Klumpfaktor) und dem Röhrchen-Koagulase-Test (freie Koagulase) durchgeführt. Positive Ergebnisse auf dem Objektträger-Koagulase-Test sollten mit dem Röhrchen-Koagulase-Test bestätigt werden. DNase-Medienplatten können ebenfalls verwendet werden, Positive erfordern jedoch eine zusätzliche Bestätigung.

Agglutinations-Kits sind weit verbreitet und können verwendet werden, um S. aureus durch Nachweis von Protein A und Klumpfaktor zu bestätigen, obwohl einige MRSA-Stämme geringe Mengen dieser Proteine aufweisen. Neuere Kits arbeiten jetzt auch mit dem Nachweis von Oberflächenantigen. Andere Latex-Kits detektieren PBP2a, das innerhalb der Zellmembran auftritt und eine Lyse der Zellen zum Nachweis erfordert.

Eine breite Palette kommerzieller biochemischer Kits ist verfügbar, sowohl manuell als auch automatisiert. Diese basieren auf einer Reihe von biochemischen Tests, die ein Profil ergeben, das anhand von Datenbanken / Tabellen bewertet wird. Viele automatisierte Systeme kombinieren die biochemische Identifizierung von S. aureus mit Antibiotika-Sensitivitätspanels zur Bestätigung von MRSA.

Antibiotika-Sensitivitätsmethoden

Die Methoden für Methicillin- und Oxacillin-Empfindlichkeitstests sind umfangreich und die veröffentlichten Daten widersprechen den Empfehlungen.

Es gibt keine einzige Methode, die für alle MRSA-Stämme geeignet ist. Standardmethoden werden von der British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) und in den USA vom Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), früher bekannt als NCCLS, veröffentlicht.

Die minimale Hemmkonzentration nach der Verdünnungsmethode war traditionell die Referenzmethode.

BSAC empfiehlt die Verwendung von Mueller Hinton- oder Columbia-Agar mit 2% NaCl und 104 kbe/ ml Inokulum, das bei 30 ° C inkubiert wurde. CLSI empfiehlt Mueller Hinton-Agar mit 2% NaCl und 104 kbe/ml Inokulum, das bei 33-35 ° C inkubiert wurde.

Molekulare Methoden, die das mecA-Gen nachweisen, ersetzen MIC als Referenzmethode.Antibiotikaempfindlichkeitstests mit Scheibendiffusionsmethoden sind nach wie vor am weitesten verbreitet, die Ergebnisse werden jedoch von einer Reihe von Faktoren beeinflusst, darunter Medium, NaCl-Konzentration, Temperatur, Inokulum und Testmittel.

Eine Reihe neuerer Studien mit der Cefoxitin-Scheibendiffusionsmethode legen eine größere Zuverlässigkeit nahe als mit Oxacillin. Es ist kein spezielles Medium oder eine spezielle Inkubationstemperatur erforderlich, und der Test wird weniger durch Hyperproduzenten von Penicillinase beeinflusst.

Das neueste CLSI-Supplement (M100-S14) schlägt die Verwendung von 30 µg Cefoxitin-Discs mit einem Haltepunkt von < = 19 mm als Hinweis auf die Resistenz von S. aureus gegen Oxacillin vor. Andere medienbasierte Methoden umfassen Agar, brühenbasierte Breakpoint-Methoden (2 mg / l Oxacillin, 4 mg / l Methicillin) und von CLSI empfohlene Agar-Screening-Methoden (zugelassener Standard M7-A6).MRSA ist nicht mehr nur eine Infektion, die in Krankenhäusern erworben wird , obwohl dies eine primäre Übertragungsquelle bleibt.In zunehmendem Maße kann MRSA in der Gemeinschaft und in der Tat von Haustieren erworben werden . Dies ist vielleicht der besorgniserregendere Trend aufgrund der potenziell großen Wirtspopulation und unterstreicht die Notwendigkeit einer deutlich verstärkten Kontrolle darüber, wie und wann Antibiotika eingesetzt werden.Die weit verbreitete Verabreichung von Antibiotika außerhalb klinisch signifikanter Anwendungen kann nur zu einer weiteren Selektion von Organismen führen, die auf höhere Antibiotikawerte reagieren.

Definitionen: Was sind ESKAPE-Erreger?

Die in den Medien oft als ‚Superbugs‘ bezeichneten ESKAPE-Erreger (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.) gelten weltweit als die häufigste Ursache für im Krankenhaus erworbene Infektionen.

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