Lithium chloride effectief doodt de honingbij parasiet Varroa destructor door een systemische werking
Pilot-studie: Van RNAi te lithium chloride
In een pilot studie, mijt-besmette honing bijen waren gehuisvest en gevoed sacharose siroop met dsRNAs van potentieel essentieel Varroa genen (Aanvullende Tabel S1). De zuivere (onbehandelde) sucrose siroop en siroop met dsRNA op basis van de coderingsvolgorde voor de groene fluorescente proteã ne GFP (dsGFP ctrl) diende als controles. GFP wordt uitgedrukt in de bioluminescent hydrozoan kwal Aequorea victoria. De GFP-opeenvolging werd gekozen als controle omdat er geen homologe gen in het genoom van honingbijen of de varroamijt bestaat. In de onbehandelde groep was de mijt mortaliteit <5%. Daarentegen werden alle mijten op bijen die sucrose-oplossing met dsRNA-targeting van Varroa-genen kregen, binnen drie dagen effectief gedood. Een identiek effect op mijten, echter, werd waargenomen in een controle-experiment waarin bijen werden gevoed GFP dsRNA (aanvullende Fig. S1). Deze resultaten sloten het voorgestelde RNAi bemiddelde mechanisme uit maar stelden of een nog onbekend effect van RNA of de activiteit van andere componenten in de testoplossing voor. Omdat hoge concentraties lithiumchloride (LiCl) werden gebruikt bij de productie van dsRNA ‘ s en daarom samen met de dsRNA aan de bijen werden gevoerd, kozen we ervoor om LiCl in sucrose-oplossing te voeren aan gekooide bijen om de werking ervan te testen tegen varroamijt. Opvallend is dat LiCl bij concentraties van 25 mM, wat overeenkomt met de berekende concentratie in de dsRNA-oplossing, de mijten even effectief doodde als de teststoffen die dsRNA bevatten. Bovendien, nadat LiCl grotendeels uit dsRNA werd verwijderd door extensief wassen (gewassen dsGFP ctrl), was de miticide activiteit aanzienlijk verminderd zoals aangegeven door vertraagde aanvang en verminderde activiteit (aanvullende Fig. S1). Uit deze gegevens concludeerden we dat LiCl, niet RNA knockdown, de waargenomen activiteit op varroamijt gemedieerd heeft en dat het de moeite waard zou zijn om het potentieel van LiCl als varroacide te analyseren.
Effectieve Concentratie van lithiumchloride
om de primaire waarnemingen van onze pilotstudie te bevestigen, hebben we koogexperimenten opgezet met verschillende concentraties van LiCl voor een robuuste statistische analyse. Naast de 25 mM concentratie, die in de pilootstudie effectief bleek te zijn, gebruikten we concentraties van 2 mM, 4 mM en 10 mM om de lagere drempel van werkzaamheid te bepalen. De resultaten ondersteunden de bevindingen van het vorige onderzoek en toonden significante miticide effecten aan voor LiCl-concentraties vanaf 2 mM waarbij een aanzienlijke toename van de mortaliteit van mijten werd aangetoond (P < 0,001, log-rank test; aanvullende tabel S2). Hogere concentraties van 10 mM en 25 mM verhoogden beide beduidend de mijtsterfte vanaf dag twee van de behandeling en bereikten de uitroeiing van meer dan 96% van de behandelde mijten aan het einde van het experiment (Fig. 1a, aanvullende tabel S2). Bij de controle-experimenten zonder LiCl in de voederoplossing bedroeg de mijtsterfte gemiddeld 9,3% en lag deze dus ruim binnen de marge van de sterfte die wordt verkregen voor mijten die onder verschillende milieuomstandigheden op onbehandelde kooibijen worden gehouden33. Op basis van deze resultaten bevestigden we een duidelijk effect van LiCl op mijt levensvatbaarheid in een concentratie range tussen 2 mM en 25 mM.
de Sterfte van phoretic Varroa mijten en bijen na de voeding lithium chloride (LiCl) te gekooide bijen. a) Kaplan-Meier–overlevingscurve van vrouwelijke varroamijt die wordt gehouden op gekooide bijen die met LiCl worden gevoed in concentraties tussen 2 mM-25 mM (n = 33, 9, 9, 12 en 9 kooien voor respectievelijk 0 mM (Controle), 2 mM, 4 mM, 10 mM en 25 mM). Bij alle concentraties was de overleving van mijten in de behandelingsgroepen significant verschillend van de controlegroep (P < 0,001, log-rank test met Bonferroni correctie). (b) Kaplan-Meier overlevingscurve van kooibijen en vrouwelijke varroamijt na 24 uur blootstelling (n = 9 kooien). De overleving van mijten in de behandelingsgroep was significant verschillend van de controlegroep (P < 0,001, log-rank test) maar er waren geen significante groepsverschillen in bijensterfte.
in deze experimenten werden de gekooide bijen gedurende enkele dagen gevoed met de respectieve concentratie LiCl totdat alle mijten door de behandeling werden gedood. Voor mogelijk gebruik in de bijenteelt verdient een kortere en gedefinieerde behandelingsperiode echter de voorkeur. Daarom hebben we een aanvullend experiment uitgevoerd, waarbij de meest effectieve concentratie van 25 mM LiCl (Fig. 1a) werd gedurende 24 uur toegediend, gevolgd door voeden met suikeroplossing gedurende nog eens zes dagen. Aan het einde van de waarnemingsperiode 92.9% van de mijten (n = 225 mijten, p < 0,001, log-rank test) werden gedood zonder enig significant effect op de behandelde bijen (zie volgende paragraaf). Dit resultaat toont duidelijk aan dat zelfs een kortdurende voeding van 25 mM LiCl voldoende is om de mijtenpopulatie aanzienlijk te verminderen.
om de hoeveelheid LiCl die de bijen innemen, die nodig is om parasitaire mijten te doden, nauwkeurig te bepalen, werden 12 pas uitgekomen bijen kunstmatig 10 µl LiCl-oplossingen van 4 mM tot 100 mM gevoerd en gedurende vijf dagen in kooien afzonderlijk met een fosfaatmijt gehouden. Met de oplossingen van 4 mM en 10 mm, die overeenkwamen met een opname van respectievelijk 1,7 µg en 4,2 µg LiCl, verschilde het effect niet significant van de onbehandelde controle (n = 12 mijten, P = 1.000, log-rank test, aanvullende tabel S3). Een enkele dosis van 25 mM, overeenkomend met 10,6 µg door de bij geconsumeerd LiCl, was echter voldoende om 100% van de phoretische mijten binnen 48 uur te doden (Fig. 2).
mortaliteit van phoretische varroamijt gehouden op bijen die afzonderlijk 10 µl lithiumchlorideoplossing kregen toegediend in concentraties variërend van 4 mM tot 100 mM. slechts één keer aan het begin van het experiment, dan kregen ze sucrose siroop gedurende vijf dagen. Voor elke concentratie werden 12 kooien met elk één bij en één varroamijt geanalyseerd. De overleving van mijten was significant verminderd in vergelijking met de controlegroep wanneer concentraties van 25 mM en hoger aan de bijen werden gevoerd (P < 0,001, log-rank test).
Effect op werkbijen
voor de analyse van de verdraagbaarheid van LiCl aan werkbijen, de testkooien die werden gebruikt om de mijtsterfte te analyseren (Fig. 1a) werden bovendien geregistreerd voor de sterfte van de werkbijen. Na blootstelling aan 2 mM, 10 mM en 25 mM LiCl, waarvan is aangetoond dat het miticide activiteit uitoefent, varieerde de behandelde werkbijensterfte gemiddeld van 3 tot 7% binnen de verschillende voedingsgroepen. Met uitzondering van de 10 mM LiCl-groep (n = 12 kooien, P = 0,015, log-rank test; aanvullende tabel S4) verschilden de waarden niet significant van de 4% sterfte in de onbehandelde controlegroep. Bovendien lagen de sterftecijfers van onze controles ruim binnen het bereik van de sterfte van niet-behandelde kooibijen die als controle in toxicologische tests34 vereist waren, waardoor de geldigheid van ons testsysteem werd bevestigd. Ook de 24 uur behandeling met LiCl had geen invloed op de sterfte van werkbijen (Fig. 1b; n = 9 kooien, P = 0,308, log-rank test). Een goede verdraagbaarheid van LiCl bij bijen werd ook bevestigd door het voederen van een enkele dosis (voor mijtsterfte zie Fig. 2) die geen significante stijging van de sterfte van werkbijenwerknemers veroorzaakten (p = 1.000, log-rank test; aanvullende tabel S5).
vervolgens werden verschillende concentraties LiCl continu gevoederd tot de laatste gekooide bij stierf om de respons op langdurige blootstelling te onderzoeken. Hier verminderde de behandeling de gemiddelde levensduur van pas uitgekomen werkbijen aanzienlijk van 26 dagen in de onbehandelde controlekooien tot 23 en 22 dagen voor respectievelijk 2 mM en 10 mM LiCl (n = 60 bijen, P = 0,024, log-rank test; aanvullende tabel S6). Bij bijen met de hoogste concentratie van 25 mm LiCl werd de levensduur aanzienlijk teruggebracht tot gemiddeld 19 dagen (Fig. 3a).
sterfte van honingbijen na toediening van lithiumchloride aan gekooide bijen. (A) Kaplan-Meier overlevingscurve van kooibijen tijdens chronische blootstelling aan LiCl. LiCl diëten in concentraties van 2 mM, 10 mM en 25 mM werden ad libitum gevoerd tot de dood van de laatste bij (n = 6 kooien met elk 10 bijen). De overleving van alle behandelde groepen was significant verschillend van de suikerstroopcontrole (P < 0,01, log-rank test met Bonferroni correctie). b)Kaplan-Meier overlevingscurve van kooibijen na een blootstelling van 24 uur. LiCl-diëten in concentraties van 2 mM, 10 mM en 25 mM werden gedurende de eerste 24 uur na het uitkomen ad libitum gevoerd en vervolgens vervangen door sacharosestroop (n = 12 kooien met elk 10 bijen). De overleving van alle behandelde groepen verschilde niet significant van de suikerstroopcontrole (P > 0,1, log-rank test met Bonferroni correctie).
echter, LiCl lijkt de levensvatbaarheid van bijen alleen te belemmeren indien het gedurende een langere periode wordt toegediend, zoals blijkt uit een aanvullend experiment waarbij LiCl gedurende de eerste 24 uur na het uitkomen werd gevoerd en vervolgens werd vervangen door sacharosestroop totdat de laatste gekooide bij stierf (Fig. 3b). Hier varieerde de gemiddelde levensduur van pas uitgekomen werkbijen van 22 dagen (10 mM) tot 24 dagen (controle) zonder significante verschillen tussen de behandelingen (n = 120 bijen per behandeling, p ≥ 0,126, log-rank test; aanvullende tabel S7). Op basis van deze gegevens van gekooide bijen concluderen we dat zelfs een kortdurende LiCl-behandeling voldoende is om de varroamijtbesmetting volledig uit te roeien met weinig of geen impact op de levensvatbaarheid van werkbijen. Deze resultaten verkregen in kooitests onder gecontroleerde omstandigheden vormen een succesvolle en veelbelovende eerste stap naar een nieuwe aanpak van Varroa-behandeling. Echter, efficiëntie en bijwerkingen moeten onder veldomstandigheden worden bevestigd.
veldproeven met lithiumchloride in kunstmatige zwermen
om de veldomstandigheden bij benadering te benaderen, hebben we 25 mM en 50 mM LiCl getest in negen broedvrije kunstmatige zwermen, bestaande uit een koningin en elk ongeveer 20.000 bijen. Deze concentraties werden gekozen op basis van eerdere experimenten met gekooide bijen waarbij de hoogste dosis werd gebruikt die nog door bijen in korte applicatietijden (25 mM) werd getolereerd. Omdat een gelijkmatige verdeling van sucrose siroop over de gehele kunstmatige zwerm van ongeveer 20.000 bijen moeilijk te bereiken was, hebben we bovendien een 50 mM concentratie LiCl getest om er zeker van te zijn dat elke Bij werd blootgesteld aan voldoende hoeveelheden lithium. Dienovereenkomstig werden de zwermen gedurende drie dagen Ad libitum gevoerd met sucrose siroop met 25 mm LiCl (n = 6) of 50 mM (n = 3), gevolgd door een lokale toepassing van Perizin®. Perizin® bevat het organofosfaat coumafos als actief ingrediënt, is een zeer effectieve varroacide die vaak wordt gebruikt als controlebehandeling35. Mijt mortaliteit werd gedurende een periode van vijf dagen gecontroleerd. Vóór de controlebehandeling doodde 25 mM LiCl ongeveer 90% van de mijten in de kunstmatige zwermen (Tabel 1). De hoger geconcentreerde oplossing (50 mM) heeft dit effect echter niet vergroot (χ2-test, P = 0,953). In totaal was de werkzaamheid iets lager in vergelijking met de kooiproeven. Een verklaring zou kunnen zijn dat de verspreiding van LiCl binnen een cluster van duizenden bijen meer tijd nodig heeft totdat de laatste individuele bij een voldoende dosering verbruikt om de respectievelijke parasitaire mijt te doden. De benodigde voedertijd van dergelijke enorme entiteiten van 20.000 bijen en meer moet worden geanalyseerd in verdere experimenten.
werkzaamheid van andere lithiumverbindingen en niet-lithiumzouten
ter bevestiging van lithium als het actieve bestanddeel voor het effect op varroamijt hebben we een reeks lithiumverbindingen getest en de miticide effecten vergeleken met andere zouten. Van bijzonder belang waren lithiumcitraat, een verbinding met drie lithiumionen, lithiumsulfaat en lithiumcarbonaat, die twee lithiumionen hebben in vergelijking met slechts één Lithiumion in LiCl. Aanvullende verbindingen met één Lithiumion (lithiumlactaat, lithiumacetaat), maar verschillende oplosbaarheid, chemische reactiviteit en prijs werden opgenomen om de werkzaamheid en verdraagbaarheid te analyseren in vergelijking met LiCl. In kooiproeven elimineerden alle verbindingen 100% van de mijten bij 25 mM binnen drie dagen (lithiumcitraat en lithiumacetaat) tot vier dagen (lithiumsulfaat, lithiumlactaat en lithiumcarbonaat). Ook, de 4-mM testoplossingen, volledig gedood phoretic mijten binnen vijf (lithiumcitraat, lithiumsulfaat, en lithiumacetaat) tot zeven dagen (lithiumlactaat) behalve lithiumcarbonaat (Tabel 2; aanvullende tabel S8).
de sterfte van Werkbijenwerknemers was bij beide concentraties niet significant verhoogd in vergelijking met de onbehandelde controlebijen, behalve voor 25 mM lithiumsulfaat en 25 mM lithiumlactaat (aanvullende tabel S9). Met deze experimenten konden we bevestigen dat andere lithiumverbindingen een vergelijkbaar potentieel hebben voor het gebruik als een systemisch acaricide. Dit kan de flexibiliteit voor het ontwerp van een diergeneesmiddel vergroten. Gezien de prijs zijn lithiumchloride en lithiumcitraat de goedkoopste verbindingen. Lithiumsulfaat is minder geschikt door de lagere bijentolerantie en lithiumcarbonaat door een relatief lage oplosbaarheid in water.
om de concentratieafhankelijke werkzaamheid van lithiumverbindingen in meer detail te onderzoeken, hebben we LiCl vergeleken met lithiumcitraat (Li3C6H5O7), dat het grootste verschil had in het aantal lithiumionen per molecuul, bij vijf verschillende concentraties in een bereik van 1 mM-25 mM. Alle concentraties lithiumcitraat vertoonden significant hogere acaricide activiteit dan LiCl, maar er was geen verschil in de sterfte van de bijen (Tabel 3, aanvullende tabellen S9 en S11). Daarom kan lithiumcitraat een nog beter actief ingrediënt vertegenwoordigen.
als een lithiumvrije controle en om chloride als actief middel uit te sluiten, hebben we ook de alkalische zouten natriumchloride (NaCl) en kaliumchloride (KCl) en ook magnesiumchloride (MgCl) op 25 mM getest. we hebben geen varroacidale werking waargenomen voor NaCl of KCl (n = 3 kooien, p = 1.000, log-rank test, aanvullende tabel S12). Bij tests met MgCl stierf 100% van de gekooide bijen binnen vijf dagen (P < 0.001, log-rank test), en volgens het dalende aantal bijen, werd het experiment beëindigd voordat het effect op mijten kon worden geanalyseerd. Op basis van deze experimenten concludeerden we dat lithium inderdaad op een dosisafhankelijke manier acaricide activiteit bemiddelt en dat lithiumcitraat de gunstigste eigenschappen vertoont van alle tot nu toe geteste verbindingen.
potentieel van lithiumverbindingen als nieuwe varroacide
we hebben aangetoond dat niet de aanvankelijk veronderstelde double stranded RNAs tegen essentiële Varroa genen, maar verrassend genoeg lithiumzouten een sterk acaricide effect op varroamijt op gekooide bijen en in kunstmatige zwermen bemiddelen. Deze resultaten tonen dus aan dat lithiumverbindingen een nieuwe klasse van acaricide middelen vormen met een uitstekend potentieel en opmerkelijk goede verdraagbaarheid door bijen. De verschillende gevoeligheid van mijten en bijen voor LiCl is des te opmerkelijker aangezien de concentratie van LiCl in het hemolymf van de bijen door verdunning waarschijnlijk aanzienlijk lager zal zijn dan de aan de bijen toegevoerde concentratie.belangrijk is dat onze bevindingen niet impliceren dat acaricide effecten van op RNAi gebaseerde benaderingen zoals gepubliceerd door Garbian et al.32 worden meestal gemedieerd door LiCl. Na het voederen van een mengsel van dsRNA aan honingbijen over een periode van 60 dagen, Garbian et al.Er werd een langzame toename van de mijt mortaliteit genoteerd met een uiteindelijke behandelingseffectiviteit van slechts 60%. Met het oog op de snelle en zeer effectieve reactie van onze kunstmatige zwermen op behandelingen met LiCl, verschillende wijzen van actie zijn waarschijnlijk: terwijl RNAi gemedieerde effecten op lange termijn effecten lijken uit te oefenen, lithiumverbindingen vertegenwoordigen een onafhankelijk mechanisme met snel begin en hoge effectiviteit.
als varroacide toont LiCl enkele unieke eigenschappen in deze combinatie: (i) LiCl handelingen systemisch via honey bee voeden (“easy-to-apply”), (ii) het is oplosbaar in water en zal daarom niet ophopen in bijenwas is een cruciaal probleem voor de lange termijn behandeling van concepten met behulp van synthetische varroacides met lipofiele properties36,37 (iii) de orale toxiciteit van de meeste lithium-verbindingen voor zoogdieren is relatief low38 (iv) het heeft geen afstotende effect op het voederen oplossing binnen de relevante concentratiebereik van 2-25 mM39 en (v) het is beschikbaar tegen redelijke prijzen. Veelbelovend is het feit dat één enkele toediening van slechts 10 µl LiCl in een 25 mM-oplossing (overeenkomend met een dosering van 10,6 µg LiCl) per individuele bij voldoende is om phoretische mijten te doden. Een uitdaging voor verder onderzoek is de ontwikkeling van een slimme toepassingstechniek voor grote zwermen en kolonies om ervoor te zorgen dat alle bijen de kritische hoeveelheid van de werkzame stof ontvangen.
momenteel weten we niet hoe LiCl de phoretische varroamijt doodt, en er zijn weinig publicaties over het effect van LiCl in insecten40. In de menselijke geneeskunde, is lithium gebruikt sinds de jaren 1870 en is een stemmingsstabiliserende agent voor de behandeling van manische episodes en als onderhoudsbehandeling voor bipolaire wanording41. Met het oog op hun therapeutisch gebruik zijn lithiumverbindingen en hun toxiciteitsprofiel zorgvuldig onderzocht. Tot dusver zijn een aantal enzymen die inwerken op het metabolisme, de ontwikkeling, de hematopoëse en andere processen voorgesteld als potentiële doelstellingen42, 43. Deze enzymen vereisen metaalionen en lithium oefent zijn activiteit uit op een niet-competitieve manier, die hoogstwaarschijnlijk voorkomt door een divalent kation te verplaatsen. Wij hebben op dit moment geen aanwijzingen dat het waargenomen miticide effect van lithiumverbindingen afhankelijk is van een vergelijkbare werking.we zijn ons er ook van bewust dat onze resultaten slechts de eerste stap vormen naar de ontwikkeling van een nieuw diergeneesmiddel. Veldproeven in vrij vliegende kolonies zijn net zo noodzakelijk als analyse van subletale en langdurige bijwerkingen op volwassen bijen en honingbijenbroed en mogelijke residuproblemen in honing.
uit de hier gepresenteerde resultaten blijkt echter al dat LiCl een doeltreffende en gemakkelijk toe te passen behandeling kan zijn voor kunstmatige en natuurlijke zwermen en met name voor het enorme aantal pakkingbijen dat in de Verenigde Staten voor bestuiving wordt Gebruikt11,44. Bovendien zou de opheldering van het werkingsmechanisme nieuwe wegen kunnen openen voor de gerichte ontwikkeling van veterinaire producten ter bestrijding van varroamijt.