PMC
dubbelstrengbreuken in DNA kunnen schade aanrichten in cellen indien niet gerepareerd. Daarom werd voorgesteld dat de uiteinden van chromosomen gespecialiseerde GLB-structuren kunnen zijn die niet als dubbele-streng onderbrekingen worden erkend, waardoor de arrestatie, degradatie en recombinationele fusie van de celcyclus worden voorkomen (Muller, 1938; McClintock, 1939). We weten nu dat telomeren de uiteinden van chromosomen bevatten en essentieel zijn voor de stabiliteit van het genoom. Telomeren zijn samengesteld uit tandem head-to-tail herhalingen van een korte g-rijke opeenvolging; bijvoorbeeld, menselijke telomeren zijn 2-20 kb van (TTAGGG)n herhalingen. De chromosoomeinden zijn niet stomp, en 3 ‘ eind (g-rijke bundel) overhangen in één enkele bundel die het binnenland van telomeer kan binnenvallen om de interne g-rijke opeenvolging te verplaatsen en een T-lijnstructuur te vormen (Griffith et al., 1999; Cesare et al., 2003; Doksani et al., 2013), aldus Beschermend de chromosoomeinden van wordt erkend door de cel als dubbel-bundel onderbrekingen, naast bescherming door proteã nen die telomere binden.
eukaryotische chromosomen worden gedupliceerd via semiconservatieve replicatie met een leidende (continue synthese voor netto groei aan het 3′ einde van de ontluikende leidende streng) en achterblijvende (discontinue Okazaki fragment synthese voor netto groei aan het 5′ einde van de ontluikende achterblijvende streng) verlengde streng zoals weergegeven in Fig. 1. In chromosomale semiconservatieve replicatie, wordt de korte inleiding van 5′ RNA van de beginnende bundel verwijderd en wordt het hiaat ingevuld door DNA dat aan het aangrenzende beginnende DNA wordt ligated. Nochtans, aan het eind van het chromosoom, kan het hiaat na verwijdering van de laatste inleiding van RNA 5 op de achterblijvende bundel niet worden ingevuld, en het chromosoom kan met elke volgende ronde van replicatie korter worden. Dit is genoemd het eind-replicatieprobleem (Watson, 1972; Olovnikov, 1973), en telomerase helpt om dit probleem op te lossen (Greider and Blackburn, 1987; Soudet et al., 2014).
DNA-replicatie aan het einde van chromosomen. (A) de replicatie van DNA kan binnen het subtelomere gebied met replicatievorken (groene pijlen) in werking stellen die bidirectioneel vanaf de oorsprong vorderen. Telomere DNA wordt gerepliceerd door een replicatievork die door dit gebied gaat. In elk paneel, wordt de leidende beginnende bundelsynthese aangegeven door een blauwe lijn met één enkele pijlpunt; de achterblijvende beginnende bundelsynthese wordt aangegeven door een blauwe lijn met veelvoudige pijlpunten. Aan de bovenkant van elk paneel, wijst de rode lijn op het signaal dat door microscopie van replicatie wordt gezien die en tijdens beleid van de eerste impuls (Idu, rood) wordt geïnitieerd en voortgezet, en wijst de gestippelde groene lijn op het signaal dat Voor replicatieuitbreiding tijdens de tweede impuls wordt gezien (cldu, groen). (B) Op sommige DNA-moleculen van muis chromosoom 14q, DNA replicatie initieert binnen de telomeer zelf. In de praktijk werd de tweede (groene) puls vaak niet waargenomen in de telomeer. (C) gedeeltelijk overlappende functies van BLM en WRN helicases worden gebruikt om G-quadruplex (G4) DNA (blauwe structuur) op te lossen die op de G-rijke ouderstreng van telomeren kan vormen. In cellen deficiënt van BLM en / of WRN helicase, is de vooruitgang van de ontluikende belangrijke streng in telomeer verminderd; de vertraagde replicatievorken worden aangegeven door rode pijlen. De resulterende replicatiespanning gaat gepaard met activering van slapende replicatieoorsprong in de subtelomeer. De cartoon wordt niet op schaal getekend, en de zelden gebruikte subtelomere replicatieoorsprong in C ligt dichter bij de telomeer dan de subtelomere oorsprong in A.
Semiconservatieve replicatie vindt plaats vóór de actie van telomerase. Eerder werd gedacht dat de replicatie van DNA bij een oorsprong in chromosomaal DNA die aan telomere wordt grenzend herhaalt, met de replicatievorken die Bidirectioneel VAN DE subtelomere oorsprong bewegen (Fig. 1 A), dus het repliceren van de telomeer. Nochtans, bleef de vraag of de replicatie van DNA met één of andere frequentie binnen telomeer zelf zou kunnen initiëren (Fig. 1 B). Deze vraag is nu bevestigend beantwoord in deze kwestie door Drosopoulos et al., die enkelvoudige molecuulanalyse van gerepliceerd DNA gebruikte (SMARD; Norio en Schildkraut, 2001). In deze benadering, worden de replicerende cellen opeenvolgend geëtiketteerd door twee verschillende nucleotideanalogen die later door immunofluorescentie worden geà dentificeerd. Bij bidirectionele replicatie worden rode signalen van de eerste puls aan elk uiteinde geflankeerd door groene signalen van de tweede puls. Eerdere rapporten met behulp van SMARD had geconcludeerd dat de meeste replicatie initieert op subtelomere gebieden in de muis en het menselijke genoom en zelden in de telomeren zelf (Sfeir et al., 2009; Drosopoulos et al., 2012). In de recente studie van Drosopoulos et al. (2015), stond de fluorescentie in situ kruising (vissen) gebruikend sondes van het telomeergebied toe het replicatiepatroon om voor een 320 kb genomic segment van het eind van muischromosoomwapen 14q worden geanalyseerd. wegens de lange tijd (4 h) voor de eerste (rode) impuls, werden gewoonlijk slechts rode traktaten van signaal binnen telomeer gezien, maar aangezien vele dergelijke molecules het rode signaal niet in het subtelomere gebied hebben uitgebreid, kan het comfortabel worden geconcludeerd dat de replicatie binnen telomere (Fig. 1 B). Bovendien, sommige moleculen hadden rood signaal in de telomeer geflankeerd door groen signaal, ondersteunen deze conclusie. Hoewel er in deze gevallen chromosoom-proximaal groen signaal was, werd chromosoom-distaal groen signaal zelden gezien. Aldus, hoewel er beperkt bewijsmateriaal voor bidirectionele replicatie was die in telomere voortkomt, is het zeer duidelijk dat een replicatieoorsprong binnen telomere juist met een replicatievork kan bestaan die zich in tijd in subtelomere uitbreidt. Het blijft te onderzoeken of replicatie initieert met een relatief hoge frequentie in de telomeren van andere chromosomen dan 14q.
Deze bevindingen doen de vraag rijzen of de oorsprong voor DNA-replicatie samenvalt met de eenvoudige sequentie herhaling gevonden in telomeren of in plaats daarvan als het samenvalt met een andere sequentie die kan worden afgewisseld binnen de telomeer. De eerste wordt voorgesteld door een studie met Xenopus cel-vrije extracten die de pre-replicatie complex kon assembleren en één of andere replicatie van DNA op exogeen DNA ondergaan die uitsluitend telomeric herhalingen bevatten (Kurth en Gautier, 2010). Soortgelijke conclusies die uit de DNA-replicatie kan starten in de eenvoudige DNA-herhalingen gevonden in centromeren waar replicatie bubbels zijn waargenomen in Drosophila virilis door elektronenmicroscopie is bereikt (Zakian, 1976), en een recente studie suggereert dat de DNA-replicatie initieert in de menselijke alpha-satelliet DNA (Erliandri et al., 2014).
replicatievorken bewegen langzaam door telomeer DNA (Ivessa et al., 2002; Makovets et al., 2004; Miller et al., 2006; Sfeir et al., 2009) wegens de hoge thermische stabiliteit van GC-rijk telomeric DNA evenals zijn neiging om stabiele secundaire structuren, zoals G-quadruplex (G4) DNA te vormen, die problemen voor de replicatie van DNA kan vormen (Lopes et al., 2011; Paeschke et al., 2011). Verschillende helicases helpen dit probleem op te lossen; bijvoorbeeld, pif1 helicase helpt om G4 (Paeschke et al., 2013). Bloom syndroom helicase (BLM) en het Werner syndroom helicase (WRN) zijn ook betrokken bij het assisteren telomeer replicatie: BLM onderdrukt replicatie-afhankelijke fragiele telomeren (Sfeir et al., 2009), en WRN onderdrukt defecten in telomere achterblijvende bundelsynthese (Crabbe et al., 2004). Drosopoulos et al. (2015) nu melden dat de belangrijke bundelsynthese die binnen telomeer initieert een langzamer tarief van vooruitgang in subtelomeer in BLM-deficiënte cellen zoals gevisualiseerd door SMARD heeft. Bovendien was er een hogere frequentie van replicatie initiatie in de 14Q subtelomeer van de BLM-deficiënte cellen, die dichter bij de telomeer ontstonden dan in BLM-Bekwame cellen. Deze waarnemingen suggereren dat slapende replicatie oorsprong in de 14Q subtelomeer kan worden geactiveerd wanneer vorkprogressie wordt belemmerd in BLM-deficiënte cellen (Fig. 1 C). Drosopoulos et al. (2015) vond ook een verhoging van subtelomere replicatieinitiatie toen de vooruitgang van de replicatievork van telomeer door aphidicolin werd gehinderd, als alternatief middel om slapende oorsprong door replicatiespanning te activeren. Toen de cellen werden behandeld met de G4 stabilisator PhenDC3, nam het vuren van de subtelomere oorsprong van 14q verder toe in BLM-deficiënte cellen. Collectief, suggereren de gegevens een vertraging van vooruitgang van belangrijke bundelsynthese van een oorsprong in 14Q telomere (gebruikend de G-rijke ouderlijke bundel als malplaatje) wanneer G4 structuren niet in BLM-deficiënte cellen kunnen worden opgelost. Als verdere ondersteuning voor een rol van BLM helicase om G4 structuren te verwijderen, was er verhoogde kleuring in BLM-deficiënte cellen door het bg4 antilichaam (Biffi et al., 2013) tegen G4 in het gehele genoom en vooral in telomeren.
WRN helicase kan G4 in vitro afwikkelen (Fry and Loeb, 1999; Mohaghegh et al., 2001). Toen Drosopoulos et al. (2015) gebruikte SMARD om replicatie in cellen dubbel deficiënt van zowel BLM als WRN te analyseren, vonden zij een duidelijke daling van rood replicatiesignaal in 14Q telomeres, die één of andere functionele overlapping tussen BLM en WRN met betrekking tot belangrijke bundelsynthese van de G-rijke bundel van telomeres voorstellen. Ter ondersteuning van deze conclusie, was er meer G4 kleuring door het bg4 antilichaam in cellen dubbel deficiënt van zowel BLM als WRN dan in cellen deficiënt van enkel BLM of enkel WRN. Dit is de eerste directe demonstratie in vivo van een bijdrage van BLM en WRN helicases in de resolutie van G4 structuren, die vooral voor vooruitgang van belangrijke bundelsynthese nodig is die in telomeren in werking stelt en van de G-rijke bundel wordt gekopieerd.