Vroege controle van tuberculose door Xpert ® MTB / RIF

aan de redactie:

vooruitgang die is geboekt om de laboratoriumcapaciteit voor de diagnose van tuberculose (TB) te verbeteren, heeft geleid tot de ontwikkeling van moleculaire analyses die nu op grote schaal conventionele microscopie en op kweek gebaseerde methoden vervangen . Helaas, de huidige Moleculaire technieken detecteren zowel levende als dode bacteriën, en een positief resultaat impliceert niet de levensvatbaarheid van de ziekteverwekker. Inderdaad, DNA kan blijven bestaan voor een lange periode na bacteriële dood en nucleïnezuur van dode bacteriën is even versterkend. Daarom zijn moleculaire analyses niet geschikt voor monitoring van de behandeling en/of voor infectiebestrijding.

we rapporteren een innovatieve aanpak om DNA afkomstig van levensvatbare Mycobacterium tuberculosis selectief te amplificeren in klinische specimens, wat nuttig is voor het monitoren van mycobacteriële belasting bij pulmonale tbc-patiënten tijdens anti-TB-behandeling.

het protocol is gebaseerd op voorbehandeling van monsters met propidium monoazide (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, USA), een chemische verbinding die het DNA van niet-levensvatbare (of membraan-beschadigde) organismen kan intercaleren, maar is uitgesloten van levensvatbare bacteriën. Na lichte activering, bindt PMA covalent aan DNA, die zijn versterking door PCR verhinderen . Na lichtBlootstelling, is ongebonden PMA niet in staat om verder met DNA-molecules in wisselwerking te staan.

de test werd eerst geoptimaliseerd met zuurvaste bacillen (AFB)-negatieve sputummonsters, verrijkt met dode of levende mycobacteriën in verschillende concentraties. Kortom, levende Mycobacterium fortuitum cellen werden toegevoegd aan n-acetyl-cysteïne ontsmet sputum monsters negatief voor AFB door uitstrijkmicroscopie in een uiteindelijke concentratie van 106 bacteriën * mL-1. Een aliquot van dit in het laboratorium gemaakte monster werd behandeld om de cellen van M. fortuitum te verwarmen. PMA voorraadoplossing werd bereid en bewaard bij -20°C en beschermd tegen blootstelling aan licht, tot gebruik, zoals aanbevolen door de fabrikanten. PMA werd toegevoegd als voorbehandeling bij een eindconcentratie van 500 µM en gedurende 30 minuten bij 4°C in het donker geïncubeerd, gevolgd door blootstelling aan blauw licht-emitterende diode (LED)-actief licht (GenIUL, Terrassa, Spanje) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. DNA werd vervolgens geëxtraheerd met behulp van een standaard fenol chloroform procedure. Als controle om de werkzaamheid van de lichtblootstellingsstap te evalueren, werd een aliquot van naakt DNA geëxtraheerd uit een M. fortuitum cultuur behandeld met 500 µM PMA eerder blootgesteld aan het LED-licht gedurende 15 minuten. De commercial line-probe assay (GenoType® Mycobacterium CM; Hain Lifescience, Nehren, Duitsland) werd vervolgens uitgevoerd om klinisch relevante mycobacteriële species te identificeren . Monsters met levend m fortuitum vertoonde een normaal hybridisatieprofiel op een nitrocellulosestrip, terwijl monsters die werden behandeld om bacteriën te doden, geen amplificatie vertoonden, behalve voor de interne controle (gegevens niet getoond). Aangezien naakt DNA behandeld met licht-geïnactiveerde PMA een normaal hybridisatieprofiel vertoonde, was de lichtblootstellingsstap efficiënt en werd de PCR niet verder geremd door residuele PMA.

nadat we het protocol voor de inactivering van DNA afkomstig van dode bacteriën geoptimaliseerd hadden, hebben we het aangepast aan de Xpert® MTB/RIF automated assay (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA). De real-time PCR die door de Xpert® MTB/RIF wordt uitgevoerd, biedt drempelcycli (Ct) die kunnen worden gebruikt om het verschil in amplificatieopbrengst tussen monsters met en zonder PMA voorbehandeling (ΔCt) te berekenen: een lage ΔCt duidt op de aanwezigheid van versterkbaar DNA van levende bacteriën, terwijl een hoge ΔCt aangeeft dat doeldna in het monster afkomstig is van dode of beschadigde bacteriën en daarom PMA voorbehandeling significant van invloed is op de amplificatie. Om de ΔCt-waarde te berekenen hebben we gekeken naar het gemiddelde tussen de Ct-waarden voor elke sonde in de Xpert® MTB/RIF-test (A tot en met E) .

we hebben het PMA-protocol Getest met behulp van de Xpert® MTB/RIF-test op een Ct-kalibratiecurve van AFB-negatieve klinische monsters met warmte-gedode/levende mycobacteriën toegevoegd in verschillende verhoudingen. Hoge dode-levende verhoudingen resulteerden in een maximaal verschil in ΔCt-waarden tussen warmtebehandelde en levende porties met PMA, terwijl monsters met een vergelijkbaar percentage gedode en levende bacteriën niet van elkaar konden worden onderscheiden door het gebruik van PMA voorbehandeling (gegevens niet getoond). Vergelijkbare gegevens zijn gerapporteerd door Kralik et al. .

ten slotte hebben we de aanpak getest op klinische specimens. 10 patiënten met de diagnose actieve pulmonale TBC (positief voor sputumuitstrijkje en positief voor kweek) werden opgenomen in het eerste validatieonderzoek. Monsters werden verzameld op het moment van diagnose (t0) en na 10-20 dagen therapie (t1), N-acetyl-cysteïne gedecontamineerd en verwerkt voor mgit-960 vloeibare cultuur (Bd Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) volgens internationale richtlijnen . Alle patiënten waren nog steeds AFB-positief door sputum uitstrijkje microscopie op t1. Tegelijkertijd werden 250 µL ontsmette monsters verwerkt voor moleculaire analyse door Xpert ® MTB / RIF assay met en zonder PMA voorbehandeling. De monsters werden vervolgens verwerkt zoals aanbevolen door de instructies van de fabrikant voor de Xpert® MTB/RIF assay.

zoals blijkt uit figuur 1, had PMA geen significante invloed op de PCR-opbrengst van de monsters die bij t0 werden verzameld (gemiddelde±sem ΔCt 2,3±0,5), terwijl de monsters die tijdens de behandeling bij t1 werden verzameld een ΔCt van 10,5±0,9 na PMA-behandeling vertoonden (p=0,0003), hetgeen bevestigde dat de positiviteit van het sputumsmeer van deze monsters voornamelijk te wijten was aan sterk beschadigde bacteriën. Bovendien bleek ΔCt berekend tussen t0 en t1 in PMA-onbehandelde monsters te laag (ΔCt 2,9±0,9) om een reële afname van de bacteriële belasting als gevolg van de therapie te kunnen vaststellen.

twee patiënten met een rating “laag” bij t0 door de Xpert® vertoonden een negatieve cultuur bij t1, terwijl alle andere patiënten met een rating “medium” of “hoog” positief bleven bij MGIT. Hoewel een exacte tijd tot positiviteit niet kan worden bepaald, merkten we op dat culturen van monsters verzameld bij t1 ongeveer 7-10 dagen later positief werden vergeleken met culturen van monsters verzameld bij t0, wat wijst op een ernstige vermindering van de levende bacteriële belasting.

alle patiënten werden met succes behandeld en genas aan het einde van de behandeling, en dit was consistent met de reductie van levende bacteriën die werd gedetecteerd door de PMA-test.

als negatieve controle hebben we retrospectief ook een geval van falen van de behandeling opgenomen (AFB-positief en kweek-positief na 5 maanden standaardbehandeling). In dit geval had de PMA voorbehandeling van zowel ontsmette sputummonsters die na 1 maand en twee tijdens de behandeling werden verzameld, geen significante invloed op de PCR-opbrengst (ΔCt 2 2), waardoor de inefficiëntie van de behandeling tegen TB werd ondersteund.

hetzelfde protocol moet in principe compatibel zijn met andere CE-goedgekeurde moleculaire tests en lijnsondetests die door de Wereldgezondheidsorganisatie zijn goedgekeurd voor de diagnose van TB; verdere studies zijn nodig om deze mogelijkheid uit te sluiten.

eerdere studies hebben de mogelijkheid aangetoond om PMA te gebruiken om levende en dode mycobacteriën te onderscheiden met een concentratie van 25-50 µM. Tijdens het opzetten van het protocol werd een eindconcentratie van 100 µM volledig vermeden van DNA-amplificatie afgeleid van warmte-gedode M. fortuitum; een zwakke achtergrond als gevolg van de amplificatie van DNA van warmte-gedode M. tuberculosis werd waargenomen (gegevens niet getoond). We kunnen speculeren dat de verschillende celwandsamenstelling op de een of andere manier de capaciteit van PMA beïnvloedt om beschadigde mycobacteriën te penetreren. Inderdaad, Kralik et al. waargenomen dat de PMA-geïnduceerde signaalreductie tussen levende en dode Mycobacterium avium subsp. paratuberculose was lager in vergelijking met die gevonden voor andere bacteriële species. Bovendien, gezien de hoeveelheid puin die mogelijk PMA moleculen in ontsmette sputa zou kunnen isoleren, verhoogden we de uiteindelijke concentratie tot 500 µM. Verder onderzoek naar verschillen in het effect van PMA-behandeling op stammen die verschillende celwandsamenstelling vertonen (bijv. Beijing-stammen) en / of in sputa met verschillende kenmerken (bijv. bloedhoudend sputum) zou het nut van deze test in verschillende klinische omgevingen beter kunnen verduidelijken.

volgens LØvdal et al. een klein deel van de cellen waarvan wordt aangenomen dat ze dood of zwaar gewond zijn, kan niet groeien. De aanwezigheid van een klein aantal cellen die zwaar gewond maar niet-cultureerbaar zijn zou kunnen verklaren waarom we nog steeds een positief signaal hebben in monsters verzameld bij t1 ondanks de PMA voorbehandeling. PMA voorbehandeling vermijdt niet de detectie van een klein deel van dode cellen (vals-positief voor een viability assay): de test kan daarom levensvatbare mycobacteriën overschatten. Vanuit klinisch perspectief zou dit echter een kleine fout betekenen in vergelijking met het risico (zeer klein voor deze test) van het onderschatten van levensvatbare mycobacteriën.

onze gegevens geven voor het eerst aan dat kwantitatieve Moleculaire technieken gecombineerd met de PMA-methode een alternatief zouden kunnen zijn voor directe microscopie en kweek voor het monitoren van vroege behandelingsrespons en voor de voorlopige evaluatie van gepersonaliseerde regimes. Het gebruik van deze analyse kan vroegere evaluatie van behandelingsdoeltreffendheid toestaan, die een duidelijke daling van de essentiële mycobacteriële lading tonen. De afwezigheid van de respons op de therapie kan echter ook onmiddellijk worden vastgesteld door de test die een verandering van het regime mogelijk maakt en de verspreiding van de infectie en verdere ontwikkeling van resistentie beperkt .

• 2 ERS 2012