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Doppelstrangbrüche in der DNA können in Zellen verheerende Folgen haben, wenn sie nicht repariert werden. Daher wurde vorgeschlagen, dass die Enden von Chromosomen spezialisierte Kappenstrukturen sein können, die nicht als Doppelstrangbrüche erkannt werden, wodurch Zellzyklusstillstand, Abbau und Rekombinationsfusion verhindert werden (Müller, 1938; McClintock, 1939). Wir wissen jetzt, dass Telomere die Enden von Chromosomen umfassen und für die Genomstabilität essentiell sind. Telomere bestehen aus Tandem-Kopf-zu-Schwanz-Wiederholungen einer kurzen G-reichen Sequenz; zum Beispiel sind menschliche Telomere 2-20 kb (TTAGGG) n Wiederholungen. Die Chromosomenenden sind nicht stumpf und das 3′-Ende (G-reicher Strang) übersteht einen einzigen Strang, der in das Innere des Telomers eindringen kann, um die interne G-reiche Sequenz zu verschieben und eine T-Schleifenstruktur zu bilden (Griffith et al., 1999; Cesare et al., 2003; Doksani et al., 2013), wodurch die Chromosomenenden zusätzlich zum Schutz durch Proteine, die das Telomer binden, vor der Erkennung durch die Zelle als Doppelstrangbrüche geschützt werden.

Eukaryotische Chromosomen werden durch semikonservative Replikation mit einem führenden (kontinuierliche Synthese für Nettowachstum am 3′-Ende des entstehenden führenden Strangs) und nacheilenden (diskontinuierliche Okazaki-Fragmentsynthese für Nettowachstum am 5′-Ende des entstehenden nacheilenden Strangs) Verlängerungsstrang dupliziert, wie in Abb. 1. Bei der chromosomalen semikonservativen Replikation wird der kurze 5′-RNA-Primer aus dem entstehenden Strang entfernt und die Lücke durch DNA gefüllt, die an die benachbarte entstehende DNA ligiert wird. Am Ende des Chromosoms kann jedoch die Lücke nach Entfernung des 5′-terminalen RNA-Primers auf dem nacheilenden Strang nicht ausgefüllt werden, und das Chromosom kann mit jeder folgenden Replikationsrunde kürzer werden. Dies wurde als Endreplikationsproblem bezeichnet (Watson, 1972; Olovnikov, 1973), und Telomerase hilft, dieses Problem zu lösen (Greider und Blackburn, 1987; Soudet et al., 2014).

Die semikonservative Replikation erfolgt vor der Wirkung der Telomerase. Bisher wurde angenommen, dass die DNA-Replikation an einem Ursprung in chromosomaler DNA neben den Telomerwiederholungen begann, wobei sich die Replikationsgabeln bidirektional vom subtelomeren Ursprung entfernten (Abb. 1A), wodurch das Telomer repliziert wird. Es blieb jedoch die Frage, ob die DNA-Replikation mit einer gewissen Häufigkeit innerhalb des Telomers selbst initiiert werden könnte (Abb. 1 B). Diese Frage wurde nun in dieser Ausgabe von Drosopoulos et al. bejaht., die eine Einzelmolekülanalyse von replizierter DNA verwendeten (SMARD; Norio und Schildkraut, 2001). Bei diesem Ansatz werden replizierende Zellen sequentiell mit zwei verschiedenen Nukleotidanaloga markiert, die anschließend durch Immunfluoreszenz identifiziert werden. Beispielsweise werden bei der bidirektionalen Replikation rote Signale aus dem ersten Impuls an jedem Ende von grünen Signalen aus dem zweiten Impuls flankiert. Frühere Berichte unter Verwendung von SMARD hatten ergeben, dass die meisten Replikationen an subtelomeren Regionen im Maus- und Humangenom und selten in den Telomeren selbst initiiert werden (Sfeir et al., 2009; Drosopoulos et al., 2012). In der aktuellen Studie von Drosopoulos et al. (2015) ermöglichte die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung von Sonden aus der Telomerregion die Analyse des Replikationsmusters für ein 320 kb großes genomisches Segment vom Ende des Mauschromosomarms 14q. Aufgrund der langen Zeit (4 h) für den ersten (roten) Impuls wurden normalerweise nur rote Signalbahnen innerhalb des Telomers gesehen, aber da viele solcher Moleküle das rote Signal nicht in die subtelomere Region ausdehnen ließen, kann bequem geschlossen werden, dass die Replikation innerhalb des Telomers begonnen haben muss (Abb. 1 B). Darüber hinaus hatten einige Moleküle ein rotes Signal im Telomer, flankiert von einem grünen Signal, was diese Schlussfolgerung stützt. Obwohl in diesen Fällen ein chromosom-proximales grünes Signal auftrat, wurde ein chromosom-distales grünes Signal selten gesehen. Obwohl es begrenzte Beweise für eine bidirektionale Replikation mit Ursprung im Telomer gab, ist es sehr klar, dass ein Replikationsursprung innerhalb des eigentlichen Telomers mit einer Replikationsgabel existieren kann, die sich im Laufe der Zeit in das Subtelomer erstreckt. Es bleibt zu untersuchen, ob die Replikation in den Telomeren anderer Chromosomen als 14q mit einer relativ hohen Frequenz initiiert wird.

Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, ob der Ursprung für die DNA-Replikation mit der einfachen Sequenzwiederholung in Telomeren übereinstimmt oder ob sie stattdessen mit einer anderen Sequenz übereinstimmt, die möglicherweise innerhalb des Telomers eingestreut ist. Ersteres wird durch eine Studie mit Xenopus-zellfreien Extrakten vorgeschlagen, die den Präreplikationskomplex zusammensetzen und eine DNA-Replikation auf exogener DNA durchführen könnten, die ausschließlich telomere Wiederholungen enthält (Kurth und Gautier, 2010). Ähnliche Schlussfolgerungen, dass die DNA-Replikation in den einfachen DNA-Wiederholungen in Zentromeren initiiert werden kann, wo Replikationsblasen in Drosophila virilis durch Elektronenmikroskopie beobachtet wurden, wurden erreicht (Zakian, 1976), und eine kürzlich durchgeführte Studie legt nahe, dass die DNA-Replikation innerhalb der menschlichen Alpha-Satelliten-DNA initiiert wird (Erliandri et al., 2014).Replikationen können sich langsam durch telomere DNA bewegen (Ivessa et al., 2002; Makovets et al., 2004; Müller et al., 2006; Sfeir et al., 2009) aufgrund der hohen thermischen Stabilität GC-reicher telomerer DNA sowie ihrer Neigung zur Bildung stabiler Sekundärstrukturen, wie G-Quadruplex (G4)-DNA, die Probleme bei der DNA-Replikation aufwerfen können (Lopes et al., 2011; Paeschke et al., 2011). Verschiedene Helikasen helfen, dieses Problem zu lösen; Zum Beispiel hilft die Pif1-Helikase, G4 abzuwickeln (Paeschke et al., 2013). Die Bloom-Syndrom-Helikase (BLM) und die Werner-Syndrom-Helikase (WRN) wurden ebenfalls mit der Unterstützung der Telomerreplikation in Verbindung gebracht: BLM unterdrückt replikationsabhängige fragile Telomere (Sfeir et al., 2009), und WRN unterdrückt Defekte in der Telomer-Lagging-Strang-Synthese (Crabbe et al., 2004). Drosopoulos et al. (2015) berichten nun, dass die führende Strangsynthese, die innerhalb des Telomers initiiert wird, eine langsamere Progressionsrate in das Subtelomer in BLM-defizienten Zellen aufweist, wie von SMARD visualisiert. Darüber hinaus gab es eine höhere Häufigkeit der Replikationsinitiierung im 14q-Subtelomer der BLM-defizienten Zellen, die näher am Telomer entsprangen als in BLM-kompetenten Zellen. Diese Beobachtungen legen nahe, dass ruhende Replikationsursprünge im 14q-Subtelomer aktiviert werden können, wenn die Gabelprogression in BLM-defizienten Zellen behindert wird (Abb. 1 C). Drosopoulos et al. (2015) fanden auch eine Zunahme der subtelomeren Replikationsinitiierung, wenn das Fortschreiten der Replikationsgabel vom Telomer durch Aphidicolin behindert wurde, als alternatives Mittel zur Aktivierung ruhender Ursprünge durch Replikationsstress. Wenn Zellen mit dem G4-Stabilisator PhenDC3 behandelt wurden, stieg das 14q-Brennen subtelomeren Ursprungs in BLM-defizienten Zellen weiter an. Zusammenfassend deuten die Daten auf eine Verlangsamung des Fortschreitens der Synthese führender Stränge von einem Ursprung im 14q-Telomer (unter Verwendung des G-reichen Elternstrangs als Vorlage) hin, wenn G4-Strukturen in BLM-defizienten Zellen nicht aufgelöst werden können. Als weitere Unterstützung für eine Rolle der BLM-Helikase bei der Entfernung von G4-Strukturen kam es in BLM-defizienten Zellen zu einer verstärkten Färbung durch den BG4-Antikörper (Biffi et al., 2013) gegen G4 im gesamten Genom und insbesondere in Telomeren.

WRN-Helikase kann G4 in vitro abwickeln (Fry und Loeb, 1999; Mohaghegh et al., 2001). Wenn Drosopoulos et al. (2015) verwendeten SMARD, um die Replikation in Zellen zu analysieren, denen sowohl BLM als auch WRN doppelt fehlten, und fanden eine deutliche Abnahme des roten Replikationssignals in 14q-Telomeren, was auf eine funktionelle Überlappung zwischen BLM und WRN im Hinblick auf die führende Strangsynthese aus dem G-reichen Strang der Telomere hindeutet. Um diese Schlussfolgerung zu stützen, gab es mehr G4-Färbung durch den BG4-Antikörper in Zellen, die doppelt an BLM und WRN mangelten, als in Zellen, die nur an BLM oder nur an WRN mangelten. Dies ist der erste direkte In-vivo-Nachweis eines Beitrags von BLM- und WRN-Helikasen zur Auflösung von G4-Strukturen, der insbesondere für die Progression der führenden Strangsynthese benötigt wird, die in Telomeren initiiert und vom G-reichen Strang kopiert wird.