Ribose

6.11.3.2 Modifikationen des Zuckers

Modifikationen an der Ribose bieten ein bemerkenswertes Maß an Kontrolle über die Zuckerkonformation im Nukleotid, das die Bindungsaffinität des Zuckers zu seiner komplementären Strang- und Duplexstruktur bestimmt. Zuckerfalten können durch Gauche- und anomere Effekte der benachbarten Hydroxylgruppen oder durch sterische Beschränkungen verändert werden.56 Die meisten Nukleotidzucker und -analoga nehmen Konformationen an, die entweder als „Nord“ (C 3′-endo und C 2′-exo) oder „Süd“ (C 2′-endo und C 3′-exo) gekennzeichnet sind. In der B-Form, die am häufigsten in doppelsträngiger DNA vorkommt, nehmen Ribosen die „Süd“ -Konformation an, während in der A-Form, die am häufigsten in doppelsträngiger RNA vorkommt, Ribosen die „Nord“ -Konformation annehmen.

Das 2′-O-methyl (2′-O-Me) nukleosidanalogon ist eine der am weitesten verbreiteten Modifikationen in ON Therapeutika. Im Vergleich zu einem DNA-Strang erhöht der Einbau von 2′-O-Me-Einheiten in ONs die Bindungsaffinität für RNA-Komplemente57 und erhöht die Nukleasestabilität.58 2′-O-Me-Ribose bevorzugt eine Nordzuckerkonformation59 und bildet A-Form-Duplexe.59b Die 2′-O-Me-Modifikation wurde in der Antisense-Forschung weit verbreitet angewendet, insbesondere wenn sie in die sogenannten „Gapmer“ -Konstrukte eingebaut wurde. 2′-O-Me-modifizierte ONs sind in vielen klinischen Versuchen60 und können im ersten von der FDA zugelassenen Aptamer, Macugen, gefunden werden.61 Diese Analoga eignen sich auch gut zur siRNA-Modifikation. Tatsächlich werden 2′-O-Me-Einheiten in siRNAs,23,27a gut toleriert, obwohl diese Modifikation nicht an jeder Stelle des RNA-Duplexes, insbesondere des Führungsstrangs, toleriert wird.Es wurde gezeigt, dass 62 2′-O-Me-Modifikationen die immunstimulatorischen Eigenschaften von siRNAs verringern.63

Die 2′-O-MOE (2′-O-(2-methoxyethyl)) -Modifikation wurde in mehreren therapeutischen Kandidaten verwendet, die sich in klinischen Studien befinden.37 Wie bei 2′-O-Me erhöht die 2′-O-MOE-Modifikation die Zielbindungsaffinität (2°C pro Insert)64 und verbessert die Nukleasestabilität.64a 2′-O-MOE-Modifikationen nehmen eine Nordzucker-Konformation an.37,64a 2′-O-MOE-Gruppen wurden erfolgreich auf Antisense UNTER Verwendung des oben genannten Gapmer-Designs und in siRNA, insbesondere im Passagierstrang, angewendet.65 Eines der zugelassenen Antisense-Therapeutika, Mipomersen, ist ein Antisense-ANTIKÖRPER der zweiten Generation, der Phosphorthioatbindungen und 2′-O-MOE-Zucker enthält.4a

Die 2′-Fluor-Modifikation ist eine weitere beliebte chemische Modifikation speziell für siRNA. 2′-fluor ist wie 2′-O-Me eine RNA-Mimik, die vorzugsweise einen North Sugar Pucker annimmt, 66 zumindest teilweise aufgrund des starken Gauche-Effekts, der durch das 2′-Fluor vermittelt wird. Ähnlich wie 2′-O-Me erhöht 2′-Fluor die Bindungsaffinität für Ziel-RNA-Sequenzen (2-3 ° C pro Insert gegenüber DNA) 37,64b,67. Die 2′-Fluor-Modifikation wird in siRNA sowohl im Führungs- als auch im Passagierstrang 62b, 68 sehr gut vertragen. Die 2′-Fluorsubstitution hat die vollständige Eliminierung von RNAs aus siRNAs ermöglicht, ohne den Einbau in RISC zu beeinträchtigen, wodurch Duplexe mit erhöhter Stabilität und Potenz bereitgestellt werden, die immer noch über die Aktivierung des RNAi-Signalwegs wirken.69 Wie 2′-O-Me finden sich auch 2′-Fluormodifikationen im FDA-zugelassenen Aptamer Macugen.61

Gesperrte Nukleinsäure (LNA) oder 2′,4′-bicyclische Nukleinsäure (2′,4′-BNA) ist ein chemisch modifiziertes RNA-Analogon, bei dem eine Methylenbrücke eine kovalente Verknüpfung zwischen dem 2′-OH und dem C-4′ des Zuckers bildet.70 Diese Nukleosidanaloga sind im Wesentlichen in einer Nordzuckerkonformation eingeschlossen, die die in RNA vorherrschende A-Form genau nachahmt, die LNA effektiv für die RNA-Bindung vororganisiert.70,71 LNA zeigt die höchsten Duplexstabilitätseffekte aller chemischen Modifikationen mit Stabilisierungen von 5-6 ° C pro Einsatz.70a Als Ergebnis haben sich LNAs in Anti-miRNA-, 72-Antisense-, 71- und siRNA-Anwendungen 62b, 73 als sehr nützlich erwiesen. Die starken Bindungseigenschaften von LNA machen sie besonders nützlich in Anti-miRNA-Anwendungen, wo kurze Sequenzen für die miRNA-Spezifität notwendig sein können. LNAs erwiesen sich als ausgezeichnete Antisense-Modifikationen, wenn sie in Gapmer-Konstrukten verwendet wurden.74 LNA-Modifikationen sind auch mit den Anforderungen der siRNA-Chemie kompatibel.73 LNA-Modifikationen zeigen eine verbesserte Nukleaseresistenz74 und können die immunstimulatorische Reaktion der siRNA verringern.63

Andere bicyclische Nukleinsäuren (BNAs) wurden im Laufe der Jahre eingeführt.65 Ein BNA-Analogon, das erfolgreich auf therapeutische Antisense-ONs der Generation 2.5 angewendet wurde, ist (S)-cEt-BNA, wobei (S)-cEt-BNAs in die 2′-O-MOE-Flanken eines MOE-Gapmers gemischt werden. (S) -cEt und LNA zeigen ähnliche Tm- und In vitro- und in vivo-Aktivitäten. (S)-cEt-BNA-ONs zeigten jedoch ein verbessertes Toxizitätsprofil im Vergleich zu LNA-ONs. Diese Daten deuten darauf hin, dass (S) -cEt BNA das Potenzial hat, den therapeutischen Index von Antisense-Medikamenten zu verbessern.65 Nukleosidanaloga auf Bicyclohexanbasis (2p-Desoxy-Methanocarbon-Nukleoside) nehmen eine Nordzuckerkonformation an, verbessern die thermische Stabilität von Duplexen und verbessern die siRNA-Serumstabilität.75 Ein weiteres konformationsbeschränktes Nukleosidanalogon, Tricyclo-DNA (tc-DNA), hat sich in der frühen Entwicklung als vielversprechend erwiesen.76 Es basiert eher auf einem trizyklischen als auf einem bizyklischen Ringsystem. tc-DNA zeigt eine erhöhte Bindungsaffinität zu RNA, aktiviert keine RNase H und ist gegenüber Nukleasen stabil.76

Im Gegensatz zur starren Natur der LNA wird auch die hochflexible Unlocked Nucleic acid (UNA) (oder „Seconucleosid“) Modifikation für die Anwendung in ON-Therapeutika entwickelt. UNA fehlt die kovalente C2’–C3′-Bindung eines Ribosezuckers, ist nicht konformationsgebunden und kann zur Beeinflussung DER Flexibilität verwendet werden.77 UNA kann Duplex-Tm bis zu 5-10 ° C pro Insertion reduzieren77,78 erleichtert aber dennoch die Antisense-Strangauswahl in den RISC-Komplex. UNA-Modifikationen, die in die Seed-Region eines siRNA-Führungsstrangs eingebracht werden, können Off-Target-Effekte signifikant reduzieren.79