The Embryo Project Encyclopedia

Von 1958 bis 1961 entwickelten Leonard Hayflick und Paul Moorhead in den USA im Labor eine Methode, um Stämme menschlicher Zellen mit vollständigen Chromosomensätzen zu kultivieren. Zuvor konnten Wissenschaftler Zellkulturen nicht mit Zellen aufrechterhalten, die zwei vollständige Sätze von Chromosomen wie normale menschliche Zellen (diploid) hatten. Infolgedessen versuchten Wissenschaftler, die menschliche Zellbiologie zu studieren, weil es keine zuverlässige Quelle von Zellen gab, die diploide menschliche Zellen repräsentierten. In ihren Experimenten schufen Hayflick und Moorhead dauerhafte Stämme menschlicher Zellen, die beide vollständigen Chromosomensätze behielten. Sie frozenesamples dann von den Kulturen, damit die Zellen für futuresearch lebensfähig blieben. Sie stellten auch fest, dass sich Zellen nur eine bestimmte Anzahl von Malen teilen konnten, bevor sie sich abbauten und starben, ein Phänomen, das später als Hayflick-Grenze bezeichnet wurde. Das Experiment von Hayflick und Moorhead ermöglichte die Erforschung von Entwicklungsbiologie und Impfstoffen, die sich auf menschliche Zellstämme stützten.

Hayflick spezialisierte sich auf die Kultivierung von Zellen in kontrollierten Umgebungen. 1958 trat er auf Einladung des neuen Direktors des Instituts, HilaryKoprowski, dem Wistar Institute in Philadelphia, Pennsylvania, bei, einer Forschungseinrichtung, die Zellbiologie und Viren studierte. Koprowski beauftragte Hayflick mit der Erstellung von Zellkulturen fürVerwenden Sie in den Experimenten anderer Forscher am Institut. Hayflicklater erinnerte sich jedoch, dass er seinen Forschungsauftrag als Gelegenheit nutzte, die Methoden und Grenzen von Zellkulturen zu untersuchen. Um Zellen zu kultivieren, rekrutierte Hayflick seinen Wistar-Kollegen Paul Moorhead, der die Struktur und Funktion von Zellen und Chromosomen untersuchte.

Der Mangel an Langlebigkeit normaler menschlicher Zellkulturen inDas Labor begrenzte die Forschung, die Wissenschaftler durchführen konnten. Mit Cellcultures züchten Wissenschaftler Zellpopulationen in Glaswaren unter kontrollierten Bedingungen für den Einsatz in der Forschung. Forscher züchten typischerweise Zellkulturen in Glaswaren oder Petrischalen, die Wachstumsmedium enthalten, eine Lösung, die gelöste Salze, Zucker und andere Zellnährstoffe enthält. Jahrhunderts stellten Forscher die Hypothese auf, dass alle normalen, gesunden Zellkulturen eine angeborene Fähigkeit hatten, sich auf der Grundlage früherer Befunde, die 1912 vom Biologen Alexis Carrel in den USA veröffentlicht wurden, unbegrenzt zu teilen. In der Praxis beobachteten die Forscher jedoch keine endlose Teilung in normalen Zellen.Stattdessen wurden die Zellen in Kultur schließlich abgebaut und starben ab. Wissenschaftler stellten fest, dass sich die Zellen verschlechterten, weil sie das Kulturwachstumsmedium mit all seinen Nährstoffen erschöpft hatten oder weil Labormitarbeiter es versäumt hatten, ideale Umweltbedingungen für das Zellwachstum aufrechtzuerhalten. Die einzigen menschlichen Zellen, die sich kontinuierlich teiltenlaboreinstellungen, unsterbliche Zelllinien genannt, waren Zellen aus Krebszellen. Diese Zelllinien stellten nur einige Aspekte der menschlichen Zellbiologie dar. Jahrhunderts konnten medizinische Forscher nicht erklären, was Krebs verursachte, und viele Wissenschaftler, darunter Hayflick und Moorhead, stellten die Hypothese auf, dass bestimmte Viren Krebswachstum verursachen könnten. Obwohl viele Mikrobiologen Zellen aus Krebszelllinien in der medizinischen Forschung verwendeten, wurden die Zellen im Allgemeinen nicht bei der Entwicklung von Impfstoffen verwendet, da die Wissenschaftler befürchteten, dass die Impfstoffe mit den krebsauslösenden Viren kontaminiert wären, die möglicherweise in den Zellen selbst enthalten sind. Darüber hinaus waren Zellen aus Krebslinien aufgrund ihrer konstanten Teilung heteroploid, was bedeutet, dass sie entweder eine größere oder eine geringere Anzahl von Chromosomen aufwiesen als normale menschliche Zellen, die zwei vollständige Chromosomensätze aufweisen. Heteroploide Zellen resultierten oft aus der kontinuierlichen Zellteilung über viele Generationen von Zellen inKultur. Hayflick und Moorehead produzierten menschliche Zellen, die über viele Generationen hinweg kultiviert werden konnten, wie Zellen aus Krebszelllinien, aber auch die diploide Chromosomenzahl der Zellen bewahrten und das Risiko verringerten, krebserregende Viren zu entwickeln. Sie beschrieben ihr Experiment in „The Serial Cultivation of Human DiploidCell Strains“, veröffentlicht 1961.

Hayflick und Moorhead versuchten, Stämme menschlicher Zellen zu entwickeln, die über lange Zeiträume im Labor kultiviert werden konnten und dennoch ihre diploide Chromosomenzahl behielten. Sie stellten die Hypothese auf, dass sie, wenn sie kleine Proben diploider menschlicher Zellen aus bereits wachsenden Kulturen in eine neue Wachstumsumgebung transplantieren würden, die Anzahl diploider Zellen in Kultur stark erhöhen würden. Hayflick und Moorhead schlugen vor, dass das Einfrieren kleiner Mengen diploider Zellen das Zellwachstum und die Zellteilung unterbrechen würde, ohne die Zellen abzutöten. Gefrorene Zellen konnten thenbe gespeichert, bis Forscher sie erforderten, an welchem Punkt sie couldthaw die gefrorenen Zellen und sie zur normalen zellulären Tätigkeit wiederherstellten.Hayflick und Moorhead sagten voraus, dass diese kultivierten Zellen nach dem Auftauen nicht heteroploid werden würden wie Zellen aus anderen Linien und ihren diploiden Chromosomensatz behalten würden. Das Experiment von Hayflick und Moorhead zielte darauf ab, sowohl eine Methode zum Züchten menschlicher Diploidzellen im Labor für langfristige Forschungszwecke zu entwickeln als auch festzustellen, ob diese Zellstämme zum Krebswachstum beigetragen haben oder nicht.Hayflick und Moorhead züchteten zuerst menschliche Zellen in Laborwachstumskulturen, transplantierten kleine Zellproben in neue Behälter, um zusätzliche Zellkulturen zu züchten, und froren Zellproben aus diesen Kulturen ein, um die Zellen für spätere Forschungen zu konservieren. Um zu testen, ob die gefrorenen Zellen für die Forschung noch lebensfähig waren, tauten Hayflick und Moorheadthaw die gefrorenen Zellen auf und versuchten, Zellkulturen daraus zu züchten.Schließlich implantierten sie Proben dieser humanen diploiden Zellstämme in lebende Gewebe, um zu sehen, ob sie zu Krebswachstum führten.

umdiploide menschliche Zellstämme zu entwickeln, begannen Hayflick und Moorhead mit der Kultivierung von Zellen aus 25 verschiedenen Geweben, die von abgetriebenen Föten stammen. Diese Zellen wurden zu 25 verschiedenen menschlichen Zellstämmen, die numerisch WI-1 bis WI-25 genannt wurden. Das WI stand für Wistar Institute, wo die Cellstrains entwickelt wurden. Hayflick und Moorhead verwendeten fötales Gewebe, da sich fötale Zellen mehr als adulte Zellen leichter zu Fibroblastenzellen entwickelten, bei denen es sich um spezialisierte Zellen handelt, die die meisten Körpergewebe strukturell unterstützen. Fibroblastenzellen waren für die Zellkultivierung im Labor bevorzugt, da sie schnell und kontinuierlich in Zellkulturen wuchsen und eine Fülle von Zellen für die Forschung bereitstellten. Hayflick und Moorhead schnitten jede der Gewebeproben in kleine, dünne Splitter und implantierten sie dann auf die Innenwand von Glasflaschen, die mit nährstoffreichem Wachstumsmedium gefüllt waren. Hayflick und Moorheaddann platzierten die gewebebeschichteten Flaschen jedes Zellstamms drei Tage lang in einer warmen Umgebung und ersetzten das Wachstumsmedium regelmäßig durch einen frischen Vorrat, um mit dem Wachstum der Zellkultur zu beginnen.

Hayflick und Moorhead ließen die Kulturen wachsen, bis die Zellen die gesamte Glasflasche bedeckten. Jede Probe von fetalen Zellen wurde dann durch einen Prozess unterteiltgenannt Subkultivierung. Während der Subkultivierung entfernten Hayflick und Moorheadremoved eine kleine Probe von Zellen und implantierten jene Zellen auf thewall einer neuen Glasflasche, die mit Wachstumsmedium gefüllt wurde und schufen eine newcell Kultur des gleichen Zellstammes. Jede neue Zellkultur stellte eine neue Generation von Zellen dar, die wiederum mit der gleichen Methode weiterkultiviert werden konnten, wodurch die Gesamtzahl der Zellen exponentiell wachsen konnte. Hayflick und Moorhead teilten dann Proben der verbleibenden Zellen in kleine Portionen und froren sie ein, um das Wachstum der Zellen anzuhalten und jede weitere Zellteilung zu stoppen.

Hayflick und Moorheadsetzten die Subkultivierung von Zellen zweimal pro Woche für etwa zehn Monate fort, an welchem Punkt die Zellkulturen aufhörten zu wachsen und begannen sich abzubauen.Hayflick und Moorhead stellten die Hypothese auf, dass die Zellen aufgehört hatten, sich zu teilen, weil sich toxische Produkte des Zellwachstums im Wachstumsmedium angesammelt hatten. Hayflick und Moorhead versuchten, frisches Wachstumsmedium einzuführen, das frei von möglichen Toxinen war, aber die Zellkulturen verschlechterten sich in den nächsten Monaten weiter und starben ab. Andere Zellkulturen, die in dasselbe Wachstumsmedium gegeben wurden, wurden jedoch nicht abgebaut und starben ab. Die Forscher kamen zu dem Schluss, dass etwas an den Zellen selbst, nicht an ihrer Umgebung, dazu führte, dass sie sich verschlechterten.Hayflick und Moorhead versuchten als nächstes festzustellen, ob die Zellen, die sie eingefroren hatten, noch verwendet werden konnten, um mehr Zellkulturen zu züchten. Nach dem Auftauen kleiner Zellproben, Hayflick und Moorheadimplantierten die Zellen auf die Wände von Glasflaschen. Sie kultivierten sie erneut in Wachstumsmedien und entdeckten, dass die Zellen auch nach dem Einfrieren noch in neuen Kulturen wuchsen, die selbst subkultiviert werden konnten. Unabhängig von früheren Einfrierungen oder Subkultivierungen könnten Forscher Proben aus diploiden menschlichen Zellkulturen verwenden, um mehr diploide menschliche Zellkulturen zu züchten. Hayflick und Moorhead hatten einen adiploiden Stamm menschlicher Zellen geschaffen, der in Laborkulturen nahezu unbegrenzt gezüchtet werden konnte. Hayflick und Moorhead untersuchten dann, ob die in den neuen Kulturen gezüchteten Zellen diploid waren oder nicht. Beim Schreiben über das Experiment sagten sie, sie seien besorgt, dass die Zellen möglicherweise nicht diploid geblieben seien, weil sie sie über viele Generationen hinweg gezüchtet hätten, was zu Heteroploidie führen könne. Mit Lichtmikroskopen untersuchten Hayflick und Moorhead Proben von Zellen während der Metaphase der Zellteilung, wenn Chromosomen unterschiedlich und leicht zu sehen sind. Sie zählten die Anzahl der Chromosomen in 250individuelle Zellen, um eine Schätzung zu erhalten, wie viele Zellen noch eine adiploide Anzahl von Chromosomen hatten. Hayflick und Moorhead stellten fest, dass mehr als 97 Prozent der Zellen auch nach mehr als zwanziggenerationen der Subkultivierung diploid waren. Hayflick und Moorhead kamen zu dem Schluss, dass ihr Prozess der seriellen Kultivierung und des Einfrierens fötaler Zellen eine wirksame Methode zur Konservierung eines diploiden menschlichen Zellstamms war.

Schließlich mussten Hayflick und Moorhead zeigen, dass ihre Zellstämme keinen Krebs verursachten. Das Problem mit den unsterblichen Zelllinien aus Krebszellen war, dass die Forscher die Hypothese aufstellten, dass die Zellen krebserregende Viren enthalten könnten. Um sicherzustellen, dass ihre neuen Zellstämme keinen Krebs verursachten, testeten Hayflick und Moorhead den Zellstamm T-25 in lebendem Gewebe. Sie wählten den WI-25-Stamm aus, weil er die meisten Unterteilungen erfahren hatte und der wahrscheinlichste Zellstamm war, der Krebs verursachte. Wenn dies nicht der Fall war, war es wahrscheinlichdass auch keiner der anderen Stämme dies tun würde.

Die Forscher implantierten Zellen aus dem Zellstamm WI-25 in die Backenbeutel von fünf lebenden Hamstern. Als experimentelle Kontrollgruppe implantierten sie auch fünf weitere Hamsterbackentaschen mit Zellen, die aus Krebszelllinien stammten. Zuerst erschienen Knötchen, ein frühes Zeichen für die Entwicklung von Krebs.in den Kontrollbeuteln beider Hamster. Nach drei Wochen waren jedoch fast alle Knötchen in den Hamstern, denen die WI-25-Zellen implantiert wurden, verschwunden, während die Knötchen in den Hamstern, denen Zellen aus Krebszelllinien implantiert wurden, alle an Größe zugenommen hatten. Hayflick und Moorhead führten Biopsien der verbleibenden Knötchen durch, um ihre Vorhersage zu bestätigen, dass ihre subkultivierten Zellen keinen Krebs verursachten.Die Biopsien zeigten, dass die Knötchen bei Hamstern, denen Zellen aus Krebszelllinien implantiert wurden, tatsächlich krebsartig waren, während die WI-25-Zellknoten auf Entzündungen und Blutungen an der Implantationsstelle zurückzuführen waren. Hayflick und Moorhead implantierten auch einen ähnlichen menschlichen Zellstrang, WI-1, in das Muskelgewebe von fünf sterbenden Krebspatienten.Er implantierte auch Zellen aus Krebszelllinien in fünf Andereterminalkrebspatienten. Wie bei den Hamstern wuchsen zunächst Knötchenan den Implantationsstellen beider Gruppen. Nach ein paar Tagen begannen die B-1-Zellknoten zurückzutreten, während sich die Knötchen bei Patienten vermehrten, denen Zellen aus Krebszelllinien implantiert wurden. Am Ende einer Woche waren fast alle WI-1-Knötchen verschwunden, und Hayflick und Moorhead biopsierten die verbleibenden Knötchen in beiden Gruppen. Die Ergebnisse der Biopsien zeigten, dass die Krebszellknoten heteroploide Zellen waren, während die WI-1-Knoten diploid und nicht krebsartig waren. Hayflick und Moorheads Ergebnisse, die sie 1961 veröffentlichten, zeigten, dass menschliche diploide Zellen über viele Generationen hinweg wie Krebszelllinien vermehrt werden konnten, ohne selbst heteroploid oder krebsartig zu werden.

Die Ergebnisse hatten einen unmittelbaren und nachhaltigen Einfluss auf das Verständnis der Entwicklungsbiologie und der wissenschaftlichen Forschung. Die Ergebnisse ihres Experiments bestätigten Carrels Hypothese von 1912, dass normale Zellen trotz Beobachtungen von Zellkulturen, die sich im Laufe der Zeit verschlechterten, unbegrenzt in Kultur wuchsen. Carrel hatte vorgeschlagen, dass es einen Grund dafür gab, dass sich die Zellen in der Praxis zu verschlechtern schienen und das Alter im Laufe der Zeit auf unvollkommene Laborwachstumsbedingungen für die Zellen zurückzuführen war.Carrel behauptete, dass Zellen in Kulturen unter idealen Bedingungen könntenauf unbestimmte Zeit teilen, effektiv als eine unsterbliche Zelllinie handeln.Die Ergebnisse von Hayflick und Moorhead zeigten jedoch, dass das Altern von Organismen auf zellulärer Ebene stattfindet, ein Prozess, der als Seneszenz bezeichnet wird, und dass Zellen nur eine begrenzte Anzahl von Teilungen durchlaufen können, bevor sie abgebaut werden und sterben. Während ihres Experiments versuchten Hayflick und Moorhead , fötale Zellen kontinuierlich zu kultivieren und altes Wachstumsmedium durch frisches, nährstoffreiches Medium zu ersetzen. Sie fanden jedoch heraus, dassNach etwa vierzig oder sechzig Generationen begannen die Zellen eher zu sterben als sich zu vermehren, ein Phänomen, das später als Hayflick-Grenze bezeichnet wurde. Das Ergebnis zeigte, dass die Zellen selbst unter idealen Bedingungen nicht unbegrenzt in Kultur wachsen konnten.

Hayflicks und Moorheads Methode der seriellen Kultivierung humaner diploider Zellen half den Wissenschaftlern auch, eine reichliche Versorgung mit diploiden menschlichen Zellen für die Forschung aufrechtzuerhalten. Nach Berechnungen von Hay Flickund Moorhead könnte ein einzelner menschlicher Zellstamm so oft subkultiviert werden, dass er fast 20 Tonnen lebensfähige Zellen produziert. Obwohl technisch nicht unsterblich, würde dieser Vorrat für praktische Forschungszwecke nahezu unerschöpflich sein.

Darüber hinaus ermöglichte die Schaffung lebensfähiger diploider menschlicher Zellen die Impfstoffforschung.Da Hayflick und Moorhead zeigten, dass ihre menschlichen Zellstämme bei Hamstern oder Menschen keinen Krebs verursachten, konnten diese Stämme in Impfstoffen verwendet werden, ohne dass die Gefahr bestand, dass der Impfstoff mit einem krebserregenden Wirkstoff kontaminiert wurde. Nachfolgende ähnlich abgeleitete menschliche Zellstämme wie WI-38 wurden zur Grundlage für Impfstoffe gegen Kinderkrankheiten wie Röteln und Windpocken. Während viele Forscher die Entwicklung menschlicher Zellstämme durch Hayflick und Moorhead begrüßten, lehnten einige, darunter die katholische Kirche, die Verwendung von abgebrochenem Fötusmaterial bei der Entwicklung von Impfstoffen aus religiösen Gründen ab. TheVatican erklärte später, dass sie Einwände gegen die Methode der Entwicklung von Impfstoffen aus fötalem Gewebe erhoben hätten, nicht gegen die Verwendung dieser Impfstoffe durch den Einzelnen zur Vorbeugung von Krankheiten. Hayflick und Moorhead demonstrierten nicht nur, dass menschliche Zellen erfolgreich im Labor kultiviert werden konnten, während sie immer noch eine diploide Anzahl von Chromosomen beibehielten, sondern auch, dass sie die Zellen fast unbegrenzt durch serielle Subkultivierung erhalten konnten. Darüber hinaus legte ihr Experiment die Grundlage für Hayflick, um die Grenze der Zellteilung in Kultur, später Hayflick-Grenze genannt, weiter zu erforschen. Die Entdeckungen von Hayflick und Moorhead ermöglichten weitere Experimente in der Entwicklungsbiologie und Impfstoffentwicklung, indem sie reichlich menschliche Zellen für die Forschung zur Verfügung stellten.