Molekulare Erkennung durch induzierte Anpassung: Wie fit ist das Konzept?

Praktisch alle biologischen Phänomene hängen auf die eine oder andere Weise von der spezifischen molekularen Erkennung ab. Ende des 19.Jahrhunderts prägte Emil Fischer seine berühmte Schlüssel-Schloss-Analogie, um die Spezifität von Enzymreaktionen darzustellen, die eine molekulare Voraussetzung für das Leben sind (4). Das Enzym wurde als starre Schablone betrachtet, in die das Substrat als Schlüssel in ein Schloss passen musste. Im Laufe der Jahre zeigte sich jedoch, dass ein starrer Sitz zwischen vorgeformten Molekülstrukturen nicht alle Aspekte der Enzymkatalyse erklären kann. Warum sollte beispielsweise ein kleineres Substrat nicht in das aktive Zentrum eines Enzyms passen, das für ein größeres Substrat ausgelegt ist? Oder warum sind einige Enzyme hochselektiv, aber andere können mehrere strukturell unterschiedliche Substratmoleküle aufnehmen?

In diesem Zusammenhang formulierte Daniel Koshland vor über 40 Jahren das Konzept des induzierten Fit (7). Um die enzymatische Reaktion ohne genaue Anpassung zu erleichtern, postulierte er, dass „das Substrat eine merkliche Veränderung der dreidimensionalen Beziehung der Aminosäuren am aktiven Ort verursachen kann“ (7). Die Idee einer präzisen Passung wurde aus dem Schloss- und Schlüsselbild beibehalten, aber es wurde ausdrücklich festgestellt, dass die Passung „erst nach den durch das Substrat selbst induzierten Änderungen auftritt“ (Hervorhebung Original). Das Konzept wurde bald zu Lehrbuchwissen und wird seitdem verwendet, um alle Arten von molekularen Erkennungsprozessen weit über Enzym-Substrat-Reaktionen hinaus zu erklären. In der Tat hat die Strukturanalyse interagierender Biomoleküle immer wieder gezeigt, dass sich ein Komplex und seine freien Komponentenmoleküle in feinen Details der Struktur unterscheiden können, in der offensichtlichen Unterstützung der Erkennung durch induzierte Anpassung. Ein gutes Beispiel dafür liefern mehrere Antigen-Antikörper-Komplexe, für die eine räumliche Anpassung durch hochauflösende Kristallstrukturanalyse nachgewiesen wurde (2). Strukturelle Plastizität zeigt sich auch in anderen Protein-Protein-Wechselwirkungen (12).

Warum sollte man ein altehrwürdiges Konzept in Frage stellen? Mein Grund ist, dass das induzierte Fit-Paragon oft zu bereit ist, um zu erklären, warum Moleküle ohne offensichtliche strukturelle Komplementarität interagieren. Das Problem liegt in der ursprünglichen Annahme, dass sich eine günstige Passform erst nach anfänglicher Bindung entwickelt, was oft zu wörtlich genommen wird. In Anbetracht der Kinetik und Thermodynamik einer Bindungsreaktion ist eine induzierte Anpassung nur möglich, wenn die Übereinstimmung zwischen den wechselwirkenden Stellen stark genug ist, um dem Anfangskomplex genügend Festigkeit und Langlebigkeit zu verleihen, so dass eine induzierte Anpassung innerhalb einer angemessenen Zeit stattfindet. Ich möchte diesen entscheidenden Punkt durch eine einfache Modellrechnung veranschaulichen, die auf dem in Abb. 1. Betrachten Sie die Moleküle A und B, die Enzym und Substrat, Antigen und Antikörper, Hormon und Rezeptor oder ein anderes Paar interagierender Moleküle sein können. Der Einfachheit halber gehe ich auch davon aus, dass der induzierte Fit nur im Molekül B auftritt, das in B* umgewandelt wird, um den stabilen Komplex AB* zu bilden. (Diese Annahme hat keinen Einfluss auf das Ergebnis der Berechnung, sondern vereinfacht den mathematischen Formalismus. Die Bindung durch induzierte Anpassung wird durch die Reaktionen 1 und 2 von Fig. 1. In Reaktion 1 interagieren A und B, um den Anfangskomplex AB zu bilden, der ein lose gebundenes Molekülpaar ist. Präzise und energetisch günstige Wechselwirkungen bilden sich danach in der Reaktion 2, bei der B durch induzierten Fit in die Konformation B* gezwungen wird. Die Energie zum „Ziehen“ und „Schieben“ von B in die passende Konformation stammt aus der optimierten Passform, die im Endkomplex AB * erreicht wurde. Die Gesamtbindungskonstante für den Komplex AB* ist K = K1 × K2 = k1 × k2/k-1 × k-2 (siehe Abb. 1 für Definitionen von Bindungskonstanten und kinetischen Geschwindigkeitskonstanten).

Stellen Sie sich als praktisches Beispiel einen Antigen-Antikörper–Komplex vor, für den K typischerweise in der Größenordnung von 108 M-1 liegt. Da Reaktion 1 ungünstig ist, nehme ich K1 als 1 M–1, woraus folgt, dass K2 = 108 M-1 ist. Weil K2 >> K1, das Gleichgewicht ist gut auf der Seite des Antigen-Antikörper-Komplexes AB *. Wenn beispielsweise 1 × 10-6 M Antikörper mit 1 × 10-6 M Antigen reagiert, beträgt das thermodynamische Gleichgewicht 91% auf der Seite des Antigen-Antikörper–Komplexes (berechnet aus K = 108 M-1 und total = total = 1 × 10-6 M, wobei eckige Klammern die Konzentration angeben). Die wichtige Frage, die oft übersehen wird, ist, wie lange es dauern wird, bis diese Gleichgewichtskonzentration erreicht ist. Der zeitliche Verlauf wird beschrieben durch

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Um die Zeit bis zum Erreichen des Gleichgewichts zu berechnen, benötigt man vernünftige Schätzungen von k1 und k2 (k–1 und k–2 folgen aus den gewählten Werten von K1 und K2; siehe Abb. 1). Die Geschwindigkeit der Bildung eines sehr schwachen Komplexes kann irgendwo zwischen 102 und 106 M–1 • s–1 liegen. Ich wähle k1 = 104 M–1 • s–1; Der Wert von k1 hat jedoch keinen großen Einfluss auf das Ergebnis der Berechnung. Konformationsänderungen in Proteinen haben Halbzeiten von Millisekunden, also wähle ich k2 = 102 s–1 (Halbzeit = 7 ms, von ln2 / k2). Die entsprechenden Werte der Rückreaktionen sind dann k–1 = 104 s–1 und k–2 = 10-6 s-1. Die numerische Integration der Gleichungen 1 und 2 für die obigen Geschwindigkeitskonstanten und 1 × 10-6 M Ausgangskonzentrationen von Antigen und Antikörper ergibt eine Halbzeit für die Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes von ~ 2,5 h. Somit dauert das Erreichen des Gleichgewichts ~ 1 Tag (~ 10 Halbzeiten). Der Grund für diese lange Reaktionszeit liegt darin, dass der instabile Antigen-Antikörper-Komplex AB nach seiner Bildung nur eine sehr geringe Chance hat, den induzierten Fit-Übergang zum stabilen Antigen-Antikörper-Komplex AB* zu durchlaufen. Die induzierte Anpassung ist zwar thermodynamisch sinnvoll, aber zu langsam, um als biologische Reaktion aussagekräftig zu sein.

Konformationsauswahl ist eine Alternative zur induzierten Anpassung

Andere Forscher, einschließlich mir (1, 3, 5, 8, 13, 14) haben darauf hingewiesen, dass es einen alternativen Mechanismus zur induzierten Anpassung gibt. Das Wesen der Konformationsauswahl, beschrieben durch die Reaktionen 3 und 4 von Abb. 1, ist, dass die Konformationsänderung nach der anfänglichen Bindung nicht angenommen wird. Dies ist eine ziemlich offensichtliche Annahme. Nehmen Sie den Antigen-Antikörper-Komplex AB*. Es dissoziiert durch Reaktion 4 in freien Antikörper A und freies Antigen B *. Daher tritt B* isoliert auf, obwohl es sich nur um eine kurzlebige Minderheitskonformation handeln kann, die durch Reaktion 3 schnell mit der Hauptkonformation B ins Gleichgewicht kommt. Um zu berechnen, wie lange es dauert, die Gleichgewichtskonzentration von AB * durch Konformationsauswahl zu erreichen, gehe ich davon aus, dass eines von tausend Molekülen in der Konformation B * (K3 = 10-3) ist. Daraus folgt, dass K4 = 1011 M–1 seit dem thermodynamischen Zyklus von Fig. 1 gemäß K1 × K2 = K3 × K4 = K = 108 M–1 erfüllt sein. Ich gehe weiter davon aus, dass die Konformationsänderung B → B* so schnell ist wie die induzierte Anpassung (k2 = k3 = 100 s–1). Weiterhin benötigt man einen Wert der Assoziationsrate von B* mit A in Reaktion 4. Gemessene Geschwindigkeitskonstanten für die Antigen-Antikörper-Bindung liegen im Bereich von 104-107 M-1•s–1 (8, 9, 11). Ich wähle einen mittleren Wert von k4 = 106 M-1 • s-1. Unter diesen Bedingungen hat die Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes AB* durch die Reaktionen 3 und 4 eine Halbwertszeit von nur 80 s; die Gleichgewichtskonzentration von AB* wird in <15 min erreicht.

Diese Berechnungen zeigen, dass die Bindung durch induzierte Anpassung nur dann sinnvoll ist, wenn ein gewisses Maß an bereits bestehender Komplementarität zwischen den interagierenden Spezies besteht; andernfalls ist der anfängliche Komplex AB zu kurzlebig (eine Annahme, die in Koshlands ursprünglicher Arbeit implizit enthalten ist). Unter Verwendung der obigen Forward-Rate-Konstanten k1 und k2 und 1 × 10-6 M Anfangskonzentrationen findet man, dass K1 ~ 104 M–1 sein muss, um die gleiche Halbwertszeit von 80 s für den induzierten Anpassungsweg wie für den Konformationsauswahlweg zu erreichen.

Experimentelle Demonstration der Bindung durch Konformationsauswahl

Überraschend wenige Studien haben versucht, Konformationsauswahl zu zeigen, obwohl sie leichter nachgewiesen werden kann als induzierte Anpassung (1, 5, 8, 15). Um die induzierte Anpassung zu demonstrieren, müsste man im Verlauf der Bindungsreaktion strukturelle Informationen abtasten, eine ziemlich schwierige Aufgabe. Um die Konformationsauswahl zu demonstrieren, muss man zeigen, dass die Bildungsrate des Komplexes AB * linear proportional zur Konzentration des passenden Konformers B * und nichtlinear proportional zur Gesamtkonzentration von B + B * ist. Wenn man die Konformationsgleichgewichtsreaktion 3 in Abwesenheit des Bindungspartners A messen kann, kann man die Konzentration von B * berechnen und die Gesamtbildungsgeschwindigkeit von AB * vorhersagen.

Ein gut untersuchtes Beispiel ist die Reaktion des einkettigen Antikörperfragments gegen das 33-Reste lange prolinhaltige Peptid GCN4-7P14P, kurz Peptid P genannt (6). Das Peptid ist in der Reihenfolge der Leucin-Zipper-Domäne des Hefe-Transkriptionsaktivators GCN4 sehr ähnlich, mit der Ausnahme, dass es keinen Leucin-Zipper bildet, da es zwei Prolinreste enthält. (Proline sind nicht kompatibel mit der helikalen Konformation eines Leucin-Reißverschlusses, der ein Dimer von Helices ist, die umeinander gewickelt sind.) Der Antikörper kreuzreagiert jedoch mit dem GCN4-Leucin-Reißverschluss, und diese Kreuzreaktion folgt eindeutig einem Konformations-Selektionsweg. Der Antikörper reagiert mit dem entfalteten Peptid, das aus dem gefalteten Leucinreißverschluss zugeführt wird (Reaktion 3). Vergleicht man die ursprüngliche Reaktion des Antikörpers mit Peptid P mit der Kreuzreaktion mit dem Leucinreißverschluss GCN4, so erwartet man, dass die Kreuzreaktion langsamer verläuft, da der Antikörper eine kleine Menge entfalteten Peptids im Gleichgewicht mit einer großen Menge gefalteten Leucinreißverschlusses selektieren muss. Darüber hinaus zeigt die Geschwindigkeit der Kreuzreaktion mit dem überwiegend gefalteten Leucin-Zipper eine nichtlineare Abhängigkeit von der Gesamtantigenkonzentration, jedoch eine lineare Abhängigkeit von der Konzentration der geringen Menge an entfaltetem Peptid (8, 15). Dies wäre nicht der Fall für einen Induced-Fit-Mechanismus, der biphasisch sein sollte, wobei die erste Phase einer bimolekularen Assoziationsreaktion entspricht, deren Geschwindigkeit linear von der Gesamtantigenkonzentration abhängt und die zweite Phase einer konzentrationsunabhängigen Konformationsumlagerung. Abbildung 2 zeigt die tatsächlichen Daten. Die Geschwindigkeit der Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes hängt linear von der Konzentration der geringen Menge an entfaltetem Peptid und nichtlinear von der Gesamtantigenkonzentration ab (Fig. 2A). Abbildung 2B zeigt die kinetischen Spuren der schnelleren Reaktion mit dem ursprünglichen Antigen und der langsameren Reaktion mit dem GCN4-Leucin-Reißverschluss. Nichtsdestotrotz ist die konformative Selektion des entfalteten Leucin-Reißverschlusses immer noch um Größenordnungen schneller als ein Induced-Fit-Weg, da die Bindung des Antikörpers an den gefalteten Leucin-Reißverschluss (Reaktion 1 von Fig. 1) ist extrem schwach (1).

Das Energielandschaftsmodell der Proteinkonformation

Gefaltete Proteine haben keine einzige einzigartige Struktur, sondern werden besser als ein großes Ensemble ähnlicher Strukturen mit ähnlichem Energieinhalt angesehen. Diese sogenannten Konformer stehen in rascher Fluktuation miteinander (10). Wenn die Energielandschaft glatt ist, tauschen sich die vielen Konformer schnell aus. Wenn es robust ist, kann das Ensemble Konformatoren enthalten, die sehr unterschiedlich sein und sich langsamer austauschen können. Somit ist die Auswahl zwischen den Strukturen B und B * eine stark vereinfachte Ansicht. In Wirklichkeit ist es eher eine Auswahl unter sehr vielen mehr oder weniger passenden Strukturen (13). Das Endergebnis der Konformationsauswahl ist jedoch dasselbe: Diejenigen Konformer, die die beste Passform zeigen, binden am besten.

Schlussfolgerungen

Die Konformationsauswahl ist eine wertvolle Alternative zur induzierten Anpassung. Dies bedeutet nicht, dass keine Bindung durch induzierte Anpassung stattfindet. Tatsächlich scheint eine Kombination aus Konformationsauswahl und induzierter Anpassung die beste Beschreibung der Wechselwirkung zwischen Molekülen zu sein, die anscheinend zunächst nicht optimal passen. Wir können uns eine Auswahl zwischen teilweise passenden Strukturen vorstellen, gefolgt von geringfügigen Anpassungen an den endgültigen stabilen Komplex (der nach der Landschaftstheorie selbst ein Ensemble ähnlicher Konformer ist). Der Hauptpunkt ist, dass induzierter Fit kein Allheilmittel sein kann, wie es in der Literatur oft behauptet wird. Die induzierte Anpassung erfordert eine vorherige molekulare Übereinstimmung, um eine ausreichende Affinität vor der Konformationsanpassung bereitzustellen. Wird diese Bedingung nicht erfüllt, führt induzierte Anpassung in einen kinetischen Engpass, auch wenn die Gesamtreaktion thermodynamisch machbar ist.