Molecular Recognition by Induced Fit: How Fit is the Concept?

käytännössä kaikki biologiset ilmiöt riippuvat tavalla tai toisella spesifisestä molekyylitunnistuksesta. 1800-luvun lopulla Emil Fischer keksi kuuluisan lukkoperäisen analogiansa kuvaamaan entsyymireaktioiden spesifisyyttä, joka on elämän molekyylinen Premissi (4). Entsyymiä pidettiin jäykkänä sapluunana, jossa substraatin piti mahtua avaimena lukkoon. Vuosien mittaan kävi kuitenkin ilmi, että esimuotoutuneiden molekyylirakenteiden välinen jäykkä istuvuus ei voi selittää kaikkia entsyymianalyysin näkökohtia. Miksi esimerkiksi pienempi substraatti ei sovi suuremmalle substraatille suunnitellun entsyymin aktiiviseen kohtaan? Tai miksi jotkin entsyymit ovat hyvin valikoivia, mutta toisiin voi mahtua useita rakenteellisesti erilaisia substraattimolekyylejä?

tässä yhteydessä Daniel Koshland muotoili yli 40 vuotta sitten käsitteen indusoitu istuvuus (7). Helpottaakseen entsymaattista reaktiota ilman tarkkaa istuvuutta hän esitti, että ”substraatti voi aiheuttaa merkittävän muutoksen aminohappojen kolmiulotteisessa suhteessa aktiivisessa kohdassa” (7). Ajatus tarkasta istuvuudesta säilyi lukkokuvasta, mutta todettiin yksiselitteisesti, että istuvuus ”tapahtuu vasta substraatin itsensä aiheuttamien muutosten jälkeen” (painotus alkuperäinen). Käsitteestä tuli pian oppikirjatietoa, ja sen jälkeen sitä on käytetty selittämään kaikenlaisia molekyylien tunnistusprosesseja, jotka ovat kaukana entsyymi-substraattireaktioista. Itse asiassa, rakenteellinen analyysi vuorovaikutuksessa biomolekyylien on osoittanut uudelleen ja uudelleen, että monimutkainen ja sen vapaa komponentti molekyylit voivat erota hienoja yksityiskohtia rakenteen, näennäinen tuki tunnustamista indusoitu sovi. Hyvä esimerkki tästä ovat useat antigeeni-vasta-ainekompleksit, joiden spatiaalinen sopeutuminen on osoitettu korkean resoluution kiderakenneanalyysillä (2). Rakenteellinen plastisuus näkyy myös muissa proteiinin ja proteiinin välisissä vuorovaikutuksissa (12).

miksi pitäisi kyseenalaistaa aikakäsitys? Syyni on, että indusoitu fit-paragon on usein liian valmis selittämään, miksi molekyylit, joilla ei ole ilmeistä rakenteellista komplementaarisuutta, vuorovaikuttavat. Ongelma on alkuperäisessä oletuksessa, että suotuisa istuvuus kehittyy vasta alkuperäisen sitomisen jälkeen, joka otetaan usein liian kirjaimellisesti. Kun otetaan huomioon sitoutumisreaktion kinetiikka ja termodynamiikka, indusoitu fit on mahdollista vain, jos vuorovaikutuskohteiden välinen ottelu on riittävän vahva antamaan alkuperäisen kompleksin riittävän lujuuden ja pitkäikäisyyden niin, että indusoitu fit tapahtuu kohtuullisessa ajassa. Haluan havainnollistaa tätä tärkeää seikkaa yksinkertaisella mallilaskelmalla, joka perustuu kuvassa esitettyyn termodynaamiseen sykliin. 1. Tarkastellaan molekyylejä A ja B, jotka voivat olla entsyymi ja substraatti, antigeeni ja vasta-aine, hormoni ja reseptori, tai mikä tahansa muu pari vuorovaikutuksessa molekyylejä. Yksinkertaisuuden vuoksi oletan myös, että indusoitunut fit esiintyy vain molekyylissä B, joka muuttuu B*: ksi muodostaen stabiilin kompleksin AB*. (Tämä oletus ei vaikuta laskennan tulokseen, vaan yksinkertaistaa matemaattista formalismia.) Indusoidun istuvuuden aiheuttama sitoutuminen kuvataan Fig: n reaktioilla 1 ja 2. 1. Reaktiossa 1 A ja B vuorovaikuttavat muodostaen alkuperäisen kompleksin AB, joka on löyhästi sitoutunut molekyylipari. Tarkkoja ja energeettisesti suotuisia vuorovaikutuksia muodostuu jälkeenpäin reaktiossa 2, Jossa B pakotetaan konformaatioon B* indusoidun Fitin avulla. Energia B: n” vetämiseen ”ja” työntämiseen ” sovituskonformaatioon on peräisin optimoidusta asennuksesta, joka saavutetaan lopullisessa AB* – kompleksissa. Kompleksin AB * yleissitovuusvakio on K = K1 × K2 = k1 × k2 / k–1 × k–2 (ks. 1 sitovien vakioiden ja kineettisten nopeusvakioiden määritelmien osalta).

käytännön esimerkkinä visioi antigeeni-vasta–ainekompleksi, jolle K on tyypillisesti luokkaa 108 M-1. Koska reaktio 1 on epäsuotuisa, otan K1: n arvoksi 1 M–1, mistä seuraa, että K2 = 108 M–1. Koska K2 >> K1, tasapainotila on hyvin antigeeni-vasta-ainekompleksin AB*puolella. Jos esimerkiksi 1 × 10-6 M vasta-aine reagoi 1 × 10-6 M antigeenin kanssa, termodynaaminen tasapaino on 91% antigeeni–vasta-ainekompleksin puolella (laskettuna k = 108 M-1 ja total = total = 1 × 10-6 M, missä hakasulkeet osoittavat konsentraation). Tärkeä kysymys, joka usein unohdetaan, on, kuinka kauan kestää saavuttaa tämä tasapaino pitoisuus. Ajankulkua kuvaa

1

2

ajan laskemiseksi tasapainoon pääsemiseksi tarvitaan kohtuulliset arviot K1: stä ja k2: sta (K–1 ja k–2 seuraavat K1: n ja K2: n valituista arvoista; KS.Kuva. 1). Hyvin heikon kompleksin muodostumisnopeus voi olla missä tahansa välillä 102 ja 106 M–1•s–1. Valitsen k1 = 104 M–1•s–1; K1: n arvolla ei kuitenkaan ole suurta vaikutusta laskennan tulokseen. Konformaatiomuutoksilla proteiineissa on puolikertoja millisekunteja, joten valitsen K2 = 102 S–1 (puoliaika = 7 ms, alkaen LN2/k2). Vastareaktioiden vastaavat arvot ovat tällöin k–1 = 104 s–1 ja k–2 = 10-6 S–1. Numeerinen integrointi yhtälöt 1 ja 2 edellä nopeusvakioita ja 1 × 10-6 M alkaen pitoisuudet antigeenin ja vasta antaa puoli-aika muodostumista antigeeni-vasta monimutkainen ~2,5 h. näin saavuttaa tasapaino kestää ~1 päivä (~10 puoli-kertaa). Syynä tähän pitkään reaktioaikaan on se, että muodostuttuaan epästabiililla antigeeni-vasta-ainekompleksilla AB on vain hyvin pieni mahdollisuus käydä läpi indusoitu fit-siirtyminen stabiiliin antigeeni-vasta-ainekompleksiin AB*. Indusoitu fit, vaikka termodynaamisesti kohtuullinen, on liian hidas ollakseen merkityksellinen biologisena reaktiona.

Konformaatiovalinta on vaihtoehto indusoidulle istuvuudelle

muut tutkijat, mukaan lukien minä (1, 3, 5, 8, 13, 14) ovat huomauttaneet, että on olemassa vaihtoehtoinen mekanismi induced fit. Konformaatiovalinnan ydin, jota kuvataan Fig: n reaktioilla 3 ja 4. 1, on, että konformaatiomuutoksen ei oleteta tapahtuvan alkuperäisen sitomisen jälkeen. Tämä on melko ilmeinen oletus. Ota antigeeni-vasta-ainekompleksi AB*. Se hajoaa vapaiksi vasta-aineiksi A ja vapaiksi antigeeneiksi B* reaktiolla 4. Näin ollen B* esiintyy eristyksissä, vaikka se saattaakin olla vain lyhytikäinen vähemmistön konformaatio, joka tasapainottuu nopeasti pääformaation B kanssa reaktiolla 3. Laskeakseni, kuinka kauan AB*: n tasapainokonsentraation saavuttaminen konformaatiovalinnan avulla kestää, oletan, että yksi tuhannesta molekyylistä on konformaatiossa B* (K3 = 10-3). Tästä seuraa, että K4 = 1011 M-1 koska termodynaaminen sykli Fig. 1 on täytettävä standardin K1 × K2 = K3 × K4 = K = 108 M–1 mukaisesti. Oletan edelleen, että konformaatiomuutos B → B* on yhtä nopea kuin indusoitu fit (k2 = k3 = 100 s–1). Lisäksi tarvitaan B*: n ja A: n assosiaationopeuden arvo reaktiossa 4. Antigeenin ja vasta-aineen sitoutumisen mitatut nopeusvakiot ovat välillä 104-107 M–1•s–1 (8, 9, 11). Valitsen keskimmäisen arvon k4 = 106 M-1•s-1. Näissä olosuhteissa antigeeni-vasta-ainekompleksin AB* muodostuminen reaktioilla 3 ja 4 puoliintumisaika on vain 80 s; Ab*: n tasapainokonsentraatio saavutetaan <15 min.

nämä laskelmat osoittavat, että indusoidulla fit: llä tapahtuva sitominen on järkevää vain, jos vuorovaikutussuhteessa olevien lajien välillä on jossain määrin keskinäistä täydentävyyttä; muuten alkuperäinen monimutkainen AB on liian lyhytikäinen (oletus implisiittinen Koshland n alkuperäinen paperi). Käyttämällä edellä mainittuja eteenpäin nopeusvakioita k1 ja k2 sekä 1 × 10-6 M alkupitoisuuksia voidaan todeta, että K1: n on oltava ~104 M–1 saavuttaakseen saman 80 s: n puoliintumisajan indusoidulle sovitusreitille kuin konformaatiovalintareitille.

kokeellinen sitoutumisen osoittaminen konformaatiovalinnalla

yllättävän harvoissa tutkimuksissa on pyritty osoittamaan konformaatiovalintaa, vaikka se on helpommin osoitettu kuin indusoitu fit (1, 5, 8, 15). Indusoidun sopivuuden osoittamiseksi olisi otettava näyte rakenteellisesta informaatiosta sitovan reaktion aikana, mikä on melko vaikea tehtävä. Konformaatiovalinnan osoittamiseksi on osoitettava, että kompleksin AB* muodostumisnopeus on lineaarisesti verrannollinen konformi B*: n konsentraatioon ja epälineaarisesti suhteessa B + B*: n kokonaiskonsentraatioon. Jos konformaatiotasapainoreaktiota 3 voidaan mitata sitoutumiskumppanin a puuttuessa, voidaan laskea B*: n konsentraatio ja ennustaa AB*: n muodostumisen kokonaisnopeus.

hyvin tutkittu esimerkki on yksiketjuisen vasta-ainepartikkelin reaktio, joka kohdistuu 33-jäämiä sisältävään pitkän proliinin sisältämään peptidiin GCN4-7P14P, jota kutsutaan nimellä peptidi P lyhyemmin (6). Peptidi muistuttaa sekvenssiltään hyvin paljon hiivan transkriptioaktivaattorin gcn4 leusiinivetoketjua, paitsi että se ei muodosta leusiinivetoketjua, koska siinä on kaksi proliinijäämää. (Proliinit eivät ole yhteensopivia leusiinivetoketjun kierteisen konformaation kanssa, joka on toisiaan kiertävien kierteiden dimeeri.) Vasta-aine kuitenkin ristireaktioi gcn4-leusiinivetoketjun kanssa, ja tämä ristireaktio seuraa selvästi konformaatioreittiä. Vasta-aine reagoi taittumattoman peptidin kanssa, jota saadaan laskostetusta leusiiniketjusta (reaktio 3). Verrattaessa vasta-aineen alkuperäistä reaktiota peptidillä P ristireaktioon leusiiniketjulla GCN4, voidaan olettaa, että ristireaktio on hitaampi, koska vasta-aineen on valittava pieni määrä avautumatonta peptidiä tasapainotilassa suuren määrän taittuneen leusiiniketjun kanssa. Lisäksi ristireaktion nopeus pääasiassa Taitetun leusiinikytkimen kanssa osoittaa epälineaarisen riippuvuuden antigeenin kokonaispitoisuudesta, mutta lineaarisen riippuvuuden avautumattoman peptidin pienen määrän pitoisuudesta (8, 15). Tämä ei päde indusoituneeseen mekanismiin, jonka pitäisi olla kaksifaasinen, jolloin ensimmäinen vaihe vastaa bimolekulaarista assosiaatioreaktiota, jonka nopeus riippuu lineaarisesti antigeenin kokonaispitoisuudesta ja toinen vaihe konsentraatiosta riippumattomaan konformaatiorakenteen uudelleenjärjestelyyn. Kuvassa 2 esitetään todelliset tiedot. Antigeeni-vasta-ainekompleksin muodostumisnopeus riippuu lineaarisesti avautumattoman peptidin pienen määrän pitoisuudesta ja epälineaarisesti antigeenin kokonaispitoisuudesta (Kuva. 2 A). Kuvassa 2b on esitetty kineettiset jäljet nopeammasta reaktiosta alkuperäisen antigeenin kanssa ja hitaammasta reaktiosta GCN4 leusiinivetoketjun kanssa. Kuitenkin konformationaalinen valinta unfolded leusiini vetoketju on edelleen suuruusluokkaa nopeammin kuin indusoitu-fit reitti, koska sitoutuminen vasta-aineen taitettu leusiini vetoketju (reaktio 1 viikuna. 1) on erittäin heikko (1).

proteiinin konformaation energiamaisemamallilla

taitetuilla proteiineilla ei ole yhtä ainutkertaista rakennetta, vaan niitä pidetään paremmin samanlaisten rakenteiden suurena kokonaisuutena, jolla on samanlainen energiasisältö. Nämä niin sanotut konformerit ovat nopeassa vaihtelussa keskenään (10). Jos energiamaisema on tasainen, monet mukautujat vaihtuvat nopeasti. Jos kokonaisuus on karu, se voi sisältää konformeja, jotka voivat olla hyvinkin erilaisia ja vaihtuvat hitaammin. Näin ollen valinta rakenteiden B ja B* välillä on räikeän yliyksinkertaistettu näkemys. Todellisuudessa se on pikemminkin valinta hyvin monien enemmän tai vähemmän istuvien rakenteiden joukosta (13). Konformaatiovalinnan lopputulos on kuitenkin sama: ne konformerit, jotka osoittavat parhaan istuvuuden, sitovat parhaiten.

päätelmät

Konformaatiovalinta on arvokas vaihtoehto indusoidulle istuvuudelle. Tämä ei tarkoita sitä, että indusoidun istuvuuden sitomista ei tapahdu. Itse asiassa konformaatiovalinnan ja indusoidun sovituksen yhdistelmä näyttäisi olevan paras kuvaus molekyylien välisestä vuorovaikutuksesta, jotka eivät ilmeisesti ole optimaalisesti sovitettavissa alkuunsa. Voimme kuvitella valinnan osittain sopivien rakenteiden välillä, jota seuraa pieniä uudelleenjärjestelyjä lopulliseen vakaaseen kompleksiin (joka maisemateorian mukaan on itsessään samanlaisten konformien kokonaisuus). Pääasia on, että aiheutettu sairaus ei voi olla parannuskeino, kuten kirjallisuudessa usein väitetään. Indusoitu fit vaatii jonkin aikaisemman molekyylikopion, jotta saadaan riittävä affiniteetti ennen konformaatiota. Jos tämä ehto ei täyty, indusoitu fit johtaa kineettiseen pullonkaulaan, vaikka kokonaisreaktio olisi termodynaamisesti toteutettavissa.